日本薬局方におけるエンドトキシン試験法

日本薬局方における
SEIKAGAKU CORPORATION
エンドトキシン試験法
標準操作法
¡光学的測定法〔カイネティック比色法〕
¡光学的測定法〔エンドポイント比色法〕
¡光学的測定法〔カイネティック比濁法〕
¡ゲル化法
ENDOTOXIN
）
CONTENTS
はじめに
2
必要試薬および器具
2
Ⅰ-1.光学的測定法
3
1.予備試験
3
2.定量
4
Ⅰ-2.光学的方法〔比色法〕における予備試験および定量の標準操作法（検量線：実数および対数目盛り）
1.ウェルリーダーを用いたカイネティック比色法標準操作法例（マイクロプレート）
2.EGリーダーSV-12を用いたカイネティック比色法操作法例（バイアル）
5
5
8
3.エンドポイント比色法操作法例（マイクロプレート）
11
4.エンドポイント比色法標準操作法（バイアル）
12
Ⅰ-3.光学的方法〔比濁法〕における予備試験および定量の標準操作法（検量線：実数および対数目盛り）
15
1.ウェルリーダーを用いたカイネティック比濁法標準操作法例
15
Ⅱ-1.ゲル化（ライセート試薬のゲル形成を指標とする）法
18
1.予備試験
18
2.限度試験法
19
3.定量試験法
20
Ⅱ-2.ゲル化法における予備試験、限度試験法および定量試験法の標準操作法
22
1.標準操作法例
22
2.測定法例
24
Ⅲ.ウェルリーダーの設定条件
26
1.カイネティック比色法（反応速度法）
26
2.エンドポイント比色法
26
3.カイネティック比濁法（反応時間法）
27
4.検量線（Select Curve）
27
Ⅳ.EGリーダーSV-12の設定条件
28
1.カイネティック比色法（反応速度法）
28
製品一覧
29
1
INTRODUCTION
はじめに
第十四改正日本薬局方第二追補７．エンドトキシン試験法に収載された試験法は、
カブトガニの血球抽出成分よ
り調製されたライセート試薬を用いて、
グラム陰性菌由来のエンドトキシンを検出または定量する方法です。本法
には、エンドトキシンの作用によるライセート試液のゲル形成を指標とするゲル化法および光学的変化を指標と
する光学的測定法があります。
以下、
これに準拠した当社製品を用いた標準操作法を示します。
必要試薬および器具
光学的変化を指標
ゲル形成を指標
比色法
カイネティック法
比濁法
エンドポイント法
マイクロプレート
バイアル
マイクロプレート
バイアル
●エンドスペシー®
ES-50Mセットま
たはトキシカラー®
LS-50Mセット
●エンドスペシー®
ES-24Sセット
●エンドスペシー®
ES-50Mセットま
たはトキシカラー®
LS-50Mセット
●エンドスペシー®
ES-24Sセット
カイネティック法
ゲル化法
マルチテスト
シングルテスト
マイクロプレート
®
●パイロテル®
●パイロテル®−T ●パイロテル
またはパイロター（感度：0.03、0.06、（感度：0.03、0.125、
0.125EU/mL）
0.25EU/mL）
ブTM −ES
●トキシカラー ®
DIAセット
●トキシカラー ®
DIA-MPセット
●日本薬局方エンドトキシン標準品（JPRSE）
（エンドトキシン100標準品またはエンドトキシン10,000標準品）
●エンドトキシン試験用水
器具
●希釈用乾熱滅菌試験管（アルミキャップ付き）
●乾熱滅菌アルミ箔
●トキシペットサンプラー100、200または1000
●トキシペットチップ200または1000（エンドトキシン、
β-グルカンフリー：以下チップ）
●トキシペットディスペンサー
●トキシペットディスペンサー用シリンジ（エンドトキシン、
β-グルカンフリー：以下シリンジ）
●試験管ミキサー
●試験管立て
●氷-水浴槽
●比色計（ウェル ●比色計（EGリー
リーダー）
ダーSV-12）
●トキシペットプ ● 乾熱滅菌アル
レート（エンド
ミキャップ
トキシン、
β-グ
ルカンフリー：
以下プレート）
●比色計
●恒温槽
●トキシペットプ
レート（エンド
トキシン、
β-グ
ルカンフリー：
以下プレート）
●比色計
●恒温槽
● 乾熱滅菌アル
ミキャップ
●比色計（ウェル
リーダー）
●トキシペットプ
レート（エンド
トキシン、
β-グ
ルカンフリー：
以下プレート）
●恒温槽
（ホットプレート
CT-961等）
●反応用乾熱滅
菌試験管
（アルミキャッ
プ付き）
●恒温槽
（ホットプレート
CT-961等）
● 乾熱滅菌アル
ミキャップ
汚染防止のためのポイント
●各バイアルの開栓はピンセットで行って下さい。
●バイアルの開栓後は、乾熱滅菌アルミ箱をご使用下さい。
●ゴム栓の再利用はしないで下さい。
●長時間標準品等を保存する場合はパラフィルムをご使用下さい。
2
ENDOTOXIN
Ⅰ
1
光学的測定法
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法概要
（予備試験および定量）
第十四改正日本薬局方第二追補におけるライセート試薬によるエンドトキシン試験法を実施するに際し
て、比色法または比濁法の精度と有効性を保証するために、予備試験として検量線の信頼性確認試験およ
び反応干渉因子試験を行う必要があります。
1. 予備試験
検量線の信頼性確認試験：ライセート試薬の各ロットごとに、また試験結果に影響を及ぼす可能性が予想
される試験条件の変更があるときに行います。
用いるライセート試薬に規定されているエンドトキシンの濃度範囲で、少なくとも3種の濃度のエンドト
キシン標準溶液を調製し、これらの各濃度の溶液につき、3回以上測定して検量線を作成します。
作成した検量線の相関係数ｒを求めるとき、その絶対値｜r｜が0.980以上であることを確認します。
反応干渉因子試験
（試験結果に影響を及ぼす可能性が予想される試験条件の変更があるときに行います。
）
まず、最大有効希釈倍数（試料溶液中に存在する反応干渉因子の影響を希釈により回避できるとき、許容
される試料溶液の最大の希釈倍数）
を次式によって求めます。
最大有効希釈倍数＝
エンドトキシン規格値 × 試料溶液の濃度
λ
エンドトキシン規格値：
投与量に基づいて規定されており、Ｋ/Ｍに等しくなります。ただし、Ｋは発熱を誘起するといわれる体
重１kg当たりのエンドトキシンの量（EU/kg）であり、Mは体重１kg当たり１時間以内に投与する注射剤の
最大量です。
試料溶液の濃度：試料溶液の濃度の単位は、
エンドトキシン規格値が
質量当たり
（EU/mg）で規定されている場合はmg/mL、
当量当たり
（EU/mEq）で規定されている場合はmEq/ｍL、
生物学的単位当たり
（EU/単位）
で規定されている場合は単位/mL、
容量当たり
（EU/mL）で規定されている場合はmL/mLです。
すなわち、エンドトキシン規格値に試料溶液の濃度を乗じることにより、試料溶液１ｍL当たりのエンド
トキシン規格値（EU/mL）が算出され、これを検量線の最小エンドトキシン濃度（λ、EU/mL）で除するこ
とにより最大有効希釈倍数が求められます。
3
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
次に、表１に従い、Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ液を調製して、試験を行います。
表１
液
Ａ
Ｂ
エンドトキシン添加濃度
0
検量線の中点濃度
※2
※3
被添加液
試験管またはウェルの数
試料溶液
※1
2以上
試料溶液
※1
2以上
Ｃ
3濃度以上
エンドトキシン試験用水
各濃度、2以上
Ｄ
0
エンドトキシン試験用水
2以上
※1 最大有効希釈倍数を超えない範囲で希釈した試料溶液を用いてもよい。
※2 検量線の中点または中点付近のエンドトキシン濃度になるように、エンドトキシン標準溶液を添加する。
※3 予備試験検量線の信頼性確認試験で用いた濃度。
反応干渉因子試験は次の条件に適合しないとき、無効です。
i）Ｃ液で作成した検量線の相関係数の絶対値は0.980以上であること。
ii）Ｄ液の測定結果は、ライセート試薬に設定されている空試験の限度値を超えないか、またはエンドト
キシンの検出限界未満であること。
Ｂ液で測定されたエンドトキシン濃度とＡ液で測定されたエンドトキシン濃度の差に基づいて、Ｂ液の
添加エンドトキシン濃度に対するエンドトキシンの回収率を計算します。添加エンドトキシンの回収率が
50∼200％の範囲にあるとき、反応干渉因子は試料溶液に存在しないと判断します。
2. 定量
操作法
表１に示すＡ，Ｂ，ＣおよびＤ液を調製し、1. 予備試験
反応干渉因子試験を準用して操作します。
エンドトキシン濃度の算出
C液で作成した検量線を用い、A液のエンドトキシン濃度を算出します。
ただし、次のすべての条件に適合しないとき、試験は無効です。
i）C液で作成した検量線の相関係数の絶対値は0.980以上であること。
ii）B液で測定されたエンドトキシン濃度とA液で測定されたエンドトキシン濃度の差に基づいて、B液の
添加エンドトキシン濃度に対するエンドトキシンの回収率を計算するとき、その回収率は50∼200％の
範囲であること。
iii）Ｄ液の結果が、ライセート試薬に設定されている空試験の限度値を超えないか、またはエンドトキシ
ンの検出限界未満であること。
判定
A液のエンドトキシン濃度に基づき、被験試料のエンドトキシンの濃度（EU/mL、EU/mg、EU/mEqま
たはEU/単位）を求め、その値が医薬品各条に規定されたエンドトキシン規格を満たすとき、被験試料はエ
ンドトキシン試験に適合します。
4
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
ENDOTOXIN
Ⅰ
2 光学的方法
〔比色法〕
における予備試験および定量の標準操作法
（検量線：実数および対数目盛り）
1. ウェルリーダーを用いたカイネティック比色法標準操作法例（マイクロプレート）
エンドトキシン標準溶液4倍希釈系列3濃度（0.1、0.025、0.00625EU/mL）
および試料溶液（10倍希
釈液）を用いる測定操作法を示します。
1）
エンドトキシン標準溶液の調製
日本薬局方エンドトキシン100標準品（JPRSE100）に100EU/mLとなるようにエンドトキシン試験
用水を加えて試験管ミキサーで2分間激しく混合し、溶解します。次に氷冷下で10倍希釈を繰り返し、
0.1EU/mLを調製後、4倍希釈を2回行い（各希釈段階では、各々1分間混合）、検量線作成用のエンドトキ
シン標準溶液を調製します。
アルミ箔
0.1mL
0.1mL
0.1mL
0.2mL
0.2mL
アルミキャップ
JPRSE
100EU/mL
エンドトキシン試験用水（mL） 0.9
エンドトキシン濃度（EU/mL） 10
0.9
1
0.9
0.1
0.6
0.025
0.6
0.00625
2）
試料溶液の2倍濃度溶液の調製
（例：10倍希釈試料溶液を測定に用いる場合は、試料原液を5倍希釈します）
0.1mL
試料原液
5
エンドトキシン試験用水 0.4mL
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
3）
各試料のプレートへの分注
エンドトキシン試験用水（D液）、1）で調製したエンドトキシン標準溶液（Ｃ液：0.00625、0.025、
0.1EU/mL）
の各50μLずつをプレートの所定のウェルに分注します
（ウェルパターン例参照）
。
※
2）
で調製した2倍濃度試料溶液を25μLずつ所定のウェル
（ＡおよびＢ液）
に分注します。さらに、Ａ液
（T1）のウェルにはエンドトキシン試験用水（D液）を、Ｂ液（T2）のウェルには検量線の中点濃度（または中点
※※
付近濃度）
のエンドトキシンの２倍濃度溶液
（0.1EU/mL）
を25μLずつ添加します
。
※分注後、
ただちにプレートに蓋をかぶせて下さい。
チップ
プレート
※※試料溶液原液で測定する場合は、その原液に中点濃度（または中点付近濃度）になるようにエンドトキシンを添加しますが、予め試験管
内でその100倍濃度のエンドトキシン標準溶液をその試料溶液で10倍希釈を2回繰り返すなどして、調製します。それを所定のB液の
ウェルに50μL分注し、試料溶液原液を所定のA液のウェルに50μL分注します。
予備試験（検量線の信頼性確認および反応干渉因子試験）
および定量同時測定のウェルパターン例
検量線の信頼性反応干渉定量用
確認試験用
因子試験用
blk：エンドトキシン試験用水
（D液）
St1∼3：エンドトキシン標準溶液（C液）
T 1：試料溶液
（A液）
T 2：エンドトキシン添加試料溶液（B液）
6
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
ENDOTOXIN
4）
ライセート試薬の溶解
®
®
エンドスペシー ES-50Mセットまたはトキシカラー LS-50Mセットのライセート試薬（④）に添付の緩
衝液（③）の全量をシリンジで加え、泡立てないように手で振って溶解します（試験管ミキサーは泡立ちの原
因になりますので使用しないで下さい）
。完全に溶解したことを確認して下さい
（通常5分以内で溶解します。
白濁が消え、透明の溶液になるのが確認できます。15分以内に使用して下さい）
。
③
シリンジ
④
5)ライセート試液の添加および反応
ライセート試液50μLをシリンジで所定のウェルに添加します。プレートに蓋をかぶせウェルリーダー
にセットします。Measureをクリックすると、直ちに攪拌され、あらかじめ設定したカイネティックモー
ドで加温および測定が開始されます。
（注）
ウェルリーダーの条件設定については、p.26の1.およびp.27の4.に従って下さい。
ウェルリーダーSK603
プレート
Wellrea
der
6)データ解析
測定終了はブザー音でお知らせします。まず、FileのSave asを実行しファイルを保存して下さい。ウェ
ルリーダーのデータ解析手順に従ってプレートパターンを目的の試験ごとに設定後、Recalcボタンをクリ
ックし、測定データを解析します。
7）
判定
1. C液で作成した検量線（横軸：エンドトキシン濃度、縦軸：測定値；実数または対数）について直線回
帰分析を行い、相関係数ｒを求め、検量線の信頼性確認試験を行います
（r≧0.980なら適合）
。
2. B液で測定されたエンドトキシン濃度とA液で測定されたエンドトキシン濃度の差に基づいて、B液の
添加エンドトキシン濃度に対するエンドトキシンの回収率を計算します（回収率が50∼200%の範囲に
あれば適合）。
3. D液の結果が、ライセート試薬に設定されている空試験の限度値を超えていないかまたはエンドトキ
シンの検出限界未満であること。限度値は本測定条件下ではカイネティック法のうちの反応速度法
（Rate
assay）では1.00mAbs/min、反応時間法（Delta-T assay）ではND（検出されず）、エンドポイント法
では0.100Absです。
7
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
4. A液のエンドトキシン濃度に基づき、被験試料（希釈しない前の元被験試料）のエンドトキシンの濃度
（EU/mL、EU/mg、EU/mEqまたはEU/単位）を求めます。その値がエンドトキシン規格を満たすとき、
被験試料（元被験試料）はエンドトキシン試験に適合します。
※別売の自動解析ソフト（EDTR、/XPまたはEDTT、/XP）を使用しますと、Reader for Windows(ウェルリーダーの制御ソフト)と連
動し、測定からデータ解析、報告書の作成・印刷までを一連の操作で自動的に行うことができます。
2. EGリーダーSV-12を用いたカイネティック比色法操作法例
（バイアル）
エンドトキシン標準溶液4倍希釈系列3濃度
（0.1、0.025、0.00625EU/mL）
および試料溶液
（10倍希
釈液）
を用いる測定操作法を示します。
1）
エンドトキシン標準溶液の調製
日本薬局方エンドトキシン100標準品（JPRSE100）に100EU/mLとなるようにエンドトキシン試験
用水を加えて試験管ミキサーで2分間激しく混合し、溶解します。次に氷冷下で10倍希釈を繰り返し、
0.1EU/mLを調製後、4倍希釈を2回行い（各希釈段階では、各々1分間混合）、検量線作成用のエンドトキ
シン標準溶液を調製します。
0.1mL
0.1mL
0.3mL
0.6mL
0.6mL
JPRSE
100EU/mL
エンドトキシン試験用水（mL）
エンドトキシン濃度（EU/mL）
0.9
10
0.9
1
2.7
0.1
1.8
0.025
1.8
0.00625
2）
ライセート試薬の溶解
（12本ずつ使用）
予備試験および定量（計36本準備）
予備試験：検量線の信頼性確認試験 12本
反応干渉因子試験 12本
定量： 12本
®
（④）
のバイアル12本に添付の緩衝液
（③）
200μLをシ
エンドスペシー ES-24Sセットのライセート試薬
リンジ等で加え、乾熱滅菌アルミキャップで蓋をし、泡立てないように混和溶解します。完全に溶解した
ことを確認してください
（通常10∼20秒間程度で溶解します）。
3）
標準品のライセート試液へ分注および反応
（予備試験：検量線の信頼性確認試験）
エンドトキシン試験用水（D液）、１）で調製したエンドトキシン標準溶液（C液：0.00625、0.025、
0.1EU/mL）の各200μLを所定のバイアル（④）に添加後、試験管ミキサーで混合します。直ちにEGリーダ
ーSV-12にセットすると、あらかじめ設定したカイネティックモードで加温および測定が開始されます
（n=3）。
8
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
ENDOTOXIN
④
予備試験
（検量線の信頼性確認試験）のパターン例
blk:エンドトキシン試験用水
（D液）
St1∼3：エンドトキシン標準溶液
（C液）
（注）
EGリーダーの条件設定については、p.28の1に従って下さい。
4）
試料溶液AおよびB液の調製
試料溶液の調製は、3）
反応
（予備試験：検量線の信頼性確認試験）
中に行って下さい。
0.1mL
A液
B液
0.9mL
−
0.4mL
0.05
0.1EU/mL（C液）
0.5mL
0.1mL
試料原液
エンドトキシン試験用水
エンドトキシン濃度（EU/mL）
試料溶液原液で測定する場合は、その原液に中点濃度
（または中点付近濃度）
になるようにエンドトキシンを添加しますが、予め試験管内で
その100倍濃度のエンドトキシン標準溶液をその試料溶液で10倍希釈を2回繰り返すなどして調製します。それを所定のB液用のバイアル
に200μL分注し、試料溶液原液を所定のA液用のバイアルに200μL分注します。3）予備試験（検量線の信頼性確認試験）の反応中に調製
して下さい。
5）
ファイルの保存
測定終了はブザー音にてお知らせします。まず、FileのSave asを実行しファイルを保存して下さい。
Auto Save機能を使用すると自動的にファイルが保存されます。
9
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
なお、SV-12では1度に12バイアルをセットでき、1回の設定で4サイクルの繰り返し測定ができますの
で反応干渉因子試験と定量が連続して行うこともできます。さらに、予備試験
（反応干渉因子試験）
を行う場
合は下記操作手順に従って下さい。
6）
標準品、A液およびB液のライセート試液へ分注および反応
（予備試験：反応干渉因子試験）
2）および3）同様に反応干渉因子試験の加温および測定を開始します（n=2）。この時、4）で調製したAお
よびB液の各200μLを所定のバイアル
（④）
に添加し、同時に測定して下さい
（n=2）。
予備試験
（反応干渉因子試験）
および定量のパターン例
blk：エンドトキシン試験用水
（D液）
St1∼3：エンドトキシン標準溶液（C液）
T 1：試料溶液
（A液）
T 2：エンドトキシン添加試料溶液（B液）
7）
ファイルの保存
測定終了後、ブザー音にてお知らせします。FileのSave asを実行しファイルを保存して下さい。さらに、
定量を行う場合は下記操作手順に従って下さい。
8）
標準品、A液およびB液のライセート試液へ分注および反応
（定量）
6）
同様に定量の加温および測定を開始します。パターンも6）
同様に使用することが可能です。
9）
データ解析
測定終了後、ブザー音にてお知らせします。まず、FileのSave asを実行しファイルを保存して下さい。
EGリーダーSV-12のデータ解析手順に従って測定データを解析します。
10）
判定
1. C液で作成した検量線（横軸：エンドトキシン濃度、縦軸：測定値；実数または対数）について直線回
帰分析を行い、相関係数ｒを求め、検量線の信頼性確認試験を行います
（r≧0.980なら適合）
。
2. B液で測定されたエンドトキシン濃度とA液で測定されたエンドトキシン濃度の差に基づいて、B液の
添加エンドトキシン濃度に対するエンドトキシンの回収率を計算します（回収率が50∼200%の範囲に
あれば適合）。
3. D液の結果が、ライセート試薬に設定されている空試験の限度値を超えていないかまたはエンドトキ
シンの検出限界未満であること。限度値は本測定条件下ではカイネティック法のうちの反応速度法
（Rate
assay）では3.00mAbs/min、反応時間法（Delta-T assay）ではND（検出されず）、エンドポイント法
では0.200Abs以下です。
10
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
ENDOTOXIN
4. A液のエンドトキシン濃度に基づき、被験試料（希釈しない前の元被験試料）のエンドトキシンの濃度
（EU/mL、EU/mg、EU/mEqまたはEU/単位）を求めます。その値がエンドトキシン規格を満たすとき、
被験試料（元被験試料）はエンドトキシン試験に適合します。
3. エンドポイント比色法操作法例
（マイクロプレート）
エンドポイント法では、特別な測定装置を必要とせず、導入の際のイニシャルコストが少なくてすみます。
プレートを用いてエンドポイント法を行う場合は、1. ウェルリーダーを用いたカイネティック比色法操
作法
（マイクロプレート）
に準じて下さい（p.5）。4)ライセート試液の溶解（p.7）後、下記の操作を行って
下さい。
1）
ライセート試液の添加および反応
ライセート試液50μLをシリンジで所定のウェルに添加します。プレートに蓋をかぶせ恒温槽で、37℃、
30分間加温します
（この加温中にジアゾカップリング試薬を調製します）
。
ジアゾカップリング試薬溶液の調製
⑧液
⑦液の全量を⑧に
加え、混合溶解
⑦
⑩液
⑨液
⑧
⑤液の全量を⑨に
加え、混合溶解
⑤
⑨
（トキシカラー
⑪液の全量を⑩に
加え、混合溶解
⑪
⑩
®DIA-MPセットを使用します）
2）
反応停止
加温終了後、直ちに1）で調製した⑧液を各ウェルに50μLずつ添加し、マイクロプレートを十分混合し
ます。さらに、⑨液50μLずつ添加後同様に混合し、次いで⑩液50μLを加え混合します。
3）
吸光度の測定およびデータ解析
再度混合し、2波長測定可能なマイクロプレートリーダーにマイクロプレートをセットし、545nm（対
照波長630nm）で吸光度を測定します。ウェルリーダーを用いる場合は、p26の2およびP.27の4のよう
に設定して下さい。
4）
判定
カイネティック比色法
（マイクロプレート）
と同様です
（p.7）
。
11
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
4. エンドポイント比色法標準操作法（バイアル）
エンドトキシン標準溶液4倍希釈系列3濃度（0.1、0.025、0.00625EU/mL）
および試料溶液（10倍希釈
液）を用いる測定操作法を示します。
１）
エンドトキシン標準溶液の調製
日本薬局方エンドトキシン100標準品
（JPRSE100）
に100EU/mLとなるようにエンドトキシン試験用
水を加えて試験管ミキサーで2分間激しく混合し、溶解します。次に氷冷下で10倍希釈を繰り返し、
0.1EU/mLを調製後、4倍希釈を2回行い（各希釈段階では、各々1分間混合）、検量線作成用のエンドトキ
シン標準溶液を調製します。
0.1mL
0.1mL
0.3mL
0.6mL
0.6mL
JPRSE
100EU/mL
エンドトキシン試験用水（mL）
エンドトキシン濃度（EU/mL）
0.9
10
0.9
1
2.7
0.1
1.8
0.025
1.8
0.00625
2）
試料溶液のAおよびB液の調製
0.1mL
A液
B液
0.9mL
−
0.4mL
0.05
0.1EU/mL（C液）
0.5mL
0.1mL
試料原液
エンドトキシン試験用水
エンドトキシン濃度（EU/mL）
試料溶液原液で測定する場合は、その原液に中点濃度（または中点付近濃度）になるようにエンドトキシンを添加しますが、予め試験管内で
その100倍濃度のエンドトキシン標準溶液をその試料溶液で10倍希釈を2回繰り返すか、あるいは１回に100倍希釈して調製します。
それを所定のB液用のバイアルに200μL分注し、試料溶液原液を所定のA液用のバイアルに200μL分注します。
®
3）
ライセート試薬（エンドスペシー ES−24Sセット）の準備
ライセート試薬
（④）の必要数のバイアルを開封し、アルミキャップで蓋をして氷冷します。
アルミキャップ
④
氷−水浴槽
12
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
ENDOTOXIN
4）
ライセート試薬の溶解
200μLをバイアル
（④）
に分注し、
溶解します。
緩衝液
（③）
④
③
チップ
氷−水浴槽
5）
検体等の添加
エンドトキシン試験用水、エンドトキシン標準溶液、試料溶液、エンドトキシン添加試料溶液の各
200μLを所定のバイアル
（④）
に添加し、試験管ミキサーで1∼2秒混合します。
チップ
氷−水浴槽
6）
加温
恒温槽で37℃、30分間加温します。
（この加温中にジアゾカップリング試薬溶液を調製します）
ジアゾカップリング試薬溶液の調製
⑧液
⑦液の全量を⑧に
加え、混合溶解
⑨液
⑩液
蒸留水12mLを
加え、混合溶解
蒸留水12mLを
加え、混合溶解
蒸留水
蒸留水
恒温槽（37℃）
⑦
⑧
12mL⑨
12mL⑩
（トキシカラー®DIAセットを使用します）
13
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
7）
反応停止
加温終了後、ただちにバイアル（④）を氷−水浴槽に移し、アルミキャップをすべて取り去り、⑧液500
μLを添加し、氷−水浴槽から取り出します。試験管ミキサーでよく混合後、⑨液500μLを加え混合し、
次いで⑩液500μLを加え混合します。
0.5mL
0.5mL
0.5mL
④
⑧
④
⑨
④
⑩
氷−水浴槽
混合
混合
混合
（注）ジアゾカップリング試薬溶液の調製およびステップ 7）の操作は、エンドトキシン、
（1→3）-β-D-グルカンフリーの
必要はありません。
8）
吸光度の測定およびデータ解析
再度混合し、蒸留水を対照として、波長545nmで吸光度を測定します（2時間以内）。
9）
判定
カイネティック比色法
（バイアル）
と同様です。
※別売の自動解析ソフト
（EDTE、/xp）
を使用しますと測定値入力後、データ解析、報告書の作成・印刷までを一連の操作で自動的に行う
ことができます。
14
ENDOTOXIN
Ⅰ
3
光学的方法〔比濁法〕における予備試験および定量の標準操作法
（検量線：実数および対数目盛り）
１．ウェルリーダーを用いたカイネティック比濁法標準操作法例
エンドトキシン標準溶液4倍希釈系列３濃度（0.1、0.025、0.00625EU/mL）および試料溶液（10倍
希釈）
を用いる測定操作法を示します。
1）
エンドトキシン標準溶液の調製
0.1mL
0.1mL
0.2mL
0.3mL
0.3mL
JPRSE
100EU/mL
エンドトキシン試験用水（mL） 0.9
エンドトキシン濃度（EU/mL） 10
0.9
1
1.8
0.1
0.9
0.025
0.9
0.00625
2）
試料溶液の2倍濃度溶液の調製
（例：10倍希釈試料溶液を測定に用いる場合は、試料原液を５倍希釈します）
0.1mL
試料原液
15
エンドトキシン試験用水 0.4mL
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
3）
各試料のプレートへの分注
エンドトキシン試験用水（D液）、1）で調製したエンドトキシン標準溶液（Ｃ液：0.00625、0.025、
0.1EU/mL）
の各100μLずつをプレートの所定のウェルに分注します
（p.6の各試験におけるウェルパター
ン例参照）
。
※
2）
で調製した試料溶液の2倍濃度溶液を50μLずつ所定のウェル
（ＡおよびＢ液）
に分注します。さらに、
Ａ液のウェルにはエンドトキシン試験用水（D液）を、Ｂ液のウェルには検量線の中点濃度（または中点付近
※
濃度）
のエンドトキシンの2倍濃度溶液
（0.1EU/mL）
を50μLずつ添加します。
※分注後、
ただちにプレートに蓋をかぶせて下さい。
チップ
プレート
試料溶液原液で測定する場合は、その原液に中点濃度
（または中点付近濃度）
になるようにエンドトキシンを添加しますが、予め試験管内で
その100倍濃度のエンドトキシン標準溶液をその試料溶液で10倍希釈を2回繰り返すか、あるいは１回に100倍希釈して調製します。そ
れを所定のB液のウェルに100μL分注し、試料溶液原液を所定のA液のウェルに100μL分注します。
4）
ライセート試薬の溶解
※
ライセート試薬パイロテルTのバイアル１本にエンドトキシン試験用水の5ｍLを加え、泡立てないよう
に手で振って溶解します（試験管ミキサーは泡立ちの原因になりますので使用しないで下さい）。完全に溶
解したことを確認して下さい（通常5分以内で溶解します。白濁が消え、透明の溶液になるのが確認できま
す）
。溶解したライセート試薬は2−8℃で保存し、24時間以内に使用して下さい。
エンドトキシン試験用水
5mL
パイロテル−T
※パイロターブESの場合は、バイアル1本にエンドトキシン試験用水の3.5mLを加えて下さい。
16
ENDOTOXIN
5）
ライセート試液の添加および反応
エンドトキシン試験用水、エンドトキシン標準溶液、試料溶液の各100μLを分注した各ウェルに、溶解
したライセート試液100μLをシリンジで添加します。プレートに蓋をかぶせウェルリーダーにセットしま
す。Measureをクリックします。直ちに攪拌され、あらかじめ設定したカイネティックモード（反応時間
法：Delta-T assay；p.27の3および4に従って設定して下さい）
で加温および測定が開始されます。
プレート
ウェルリーダーSK603
Wellre
ader
6）
データ解析
測定終了はブザー音にてお知らせします。まず、FileのSave asを実行しファイルを保存してください。
ウェルリーダーのデータ解析手順に従って測定データを解析します。
7）
判定
比色法に準じて下さい
（p.7の7）
参照）。
※別売の自動解析ソフト
（EDTT、/XP）を使用しますと、Reader for Windows(ウェルリーダーの制御ソフト)と連動し、測定からデ
ータ解析、報告書の作成・印刷までを一連の操作で自動的に行うことができます。
17
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
Ⅱ
1
ゲル化（ライセート試薬のゲル形成を指標とする）法
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法概要
（予備試験、限度試験法および定量試験法）
第十四改正日本薬局方第二追補におけるライセート試薬によるエンドトキシン試験法を実施するに際し
て、ゲル化法の精度と有効性を保証するために予備試験としてライセート試薬の表示感度確認試験および
反応干渉因子試験を行う必要があります。
1. 予備試験
ライセート試薬の表示感度確認試験：ライセート試薬の各ロットごとに、また試験結果に影響を及ぼす
可能性が予想される試験条件の変更があるときに行います。
ライセート試薬の表示感度とは、ライセート試薬に規定されている条件下での凝固（ゲル形成）に必要な最
小エンドトキシン濃度です。使用する前にその表示感度λを確認しなければなりません。
本試験は、調製した4種（2λ、1λ、0.5λ、0.25λ）の濃度のエンドトキシン標準溶液を用いて、この4
種の液を１組とした試験を4回行います。
各回の試験において、陽性を示す最小エンドトキシン濃度をエンドポイント濃度とし、次の式によって幾
何平均エンドポイント濃度を求めます。
幾何平均エンドポイント濃度＝antilog(Σe/ f )
Σe：各回のエンドポイント濃度の対数ｅの和
f：試験の回数
各回の試験において、濃度0.25λのエンドトキシン標準溶液がすべて陰性を示さないとき、試験は無効で
す。
求めた幾何平均エンドポイント濃度が0.5∼2.0λの範囲にあるとき、ライセート試薬の表示感度は確認さ
れたことになります。
反応干渉因子試験：試験結果に影響を及ぼす可能性が予想される試験条件の変更があるとき行います。
本試験は、試料溶液について、反応を促進または阻害する因子の有無を調べる試験です。
表2に従い、Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ液を調製して、試験を行います。
18
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
ENDOTOXIN
表2
液
エンドトキシン添加濃度
希釈液
希釈倍数
/被添加液
希釈後の添加
エンドトキシンの濃度
Ａ
0/試料溶液
―
―
―
Ｂ
2λ/試料溶液
試料溶液
1
2λ
Ｃ
Ｄ
2λ/エンドトキシン試
エンドトキシン
験用水
試験用水
0/エンドトキシン試験
試験の回数
―
2
1λ
4
0.5λ
8
0.25λ
1
2λ
2
1λ
4
0.5λ
8
0.25λ
―
―
4
4
2
2
用水
ＡおよびＤ液のすべてが陰性を示し、Ｃ液の試験結果によりライセート試薬の表示感度が確認されたとき、
反応干渉因子試験は有効とします。
Ｂ液の試験において幾何平均エンドポイント濃度が0.5∼2.0λの範囲にあるとき、試料溶液は反応干渉因
子試験に適合します。
試料溶液に反応干渉作用が認められるとき、最大有効希釈倍数（p.4参照）を超えない範囲でさらに希釈し、
試験を行います。
2. 限度試験法
本法は、試料溶液に規格値を超えるエンドトキシンが含まれるか否かを、ライセート試薬の表示感度を
指標とし、ゲル化反応により判定する方法です。
表3に従い、Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ液を調製します。ＡおよびＢ液の試料溶液は 1.予備試験
試験に適合する溶液を用います。
表3
19
液
エンドトキシン添加濃度/被添加液
試験の回数
Ａ
0/試料溶液
2
Ｂ
2λ/試料溶液
2
Ｃ
2λ/エンドトキシン試験用水
2
Ｄ
0/エンドトキシン試験用水
2
反応干渉因子
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
判定：
1. ＢおよびＣ液の2回の試験結果がいずれも陽性で、Ｄ液の2回の試験結果がいずれも陰性のとき、試験は
有効とします。
2. A液の２回の試験結果において
適合：いずれも陰性のとき
不適：いずれも陽性のとき
１回が陰性で他の１回が陽性のとき、この２回の試験を繰り返し行います。
適合：その２回の試験結果がいずれも陰性のとき
不適：両方若しくは一方が陽性の場合
ただし、陽性の結果が得られたいずれの場合でも、試料溶液の希釈倍数が最大有効希釈倍数未満の場合、
最大有効希釈倍数あるいはそれを越えない希釈倍数で試験をやり直すことができます。
3. 定量試験法
本法は、試料溶液中のエンドトキシン濃度をゲル化反応のエンドポイントを求めることによって測定す
る方法です。
操作法
表4に従い、Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ液を調製します。ＡおよびＢ液の試料溶液は、１．予備試験
反応干渉因
子試験に適合する溶液を用います。
表4
液
エンドトキシン添加濃度
希釈液
希釈倍数
※
/被添加液
Ａ
0/試料溶液
希釈後の添加
エンドトキシンの濃度
エンドトキシン
1
―
試験用水
2
―
4
―
8
―
―
1
2λ
Ｂ
2λ/試料溶液
Ｃ
2λ/エンドトキシン試
エンドトキシン
1
2λ
験用水
試験用水
2
1λ
4
0.5λ
8
0.25λ
―
―
Ｄ
0/エンドトキシン試験
試験の回数
―
2
2
2
2
用水
※ A液の段階希釈は、最大有効希釈倍数を超えない範囲で適宜変更してよい。
20
ENDOTOXIN
エンドトキシン濃度の算出および判定
i）試験の有効性：2回の試験でいずれも、D液は陰性を、B液は陽性を示し、C液の幾何平均エンドポイン
ト濃度が0.5∼2.0λの範囲にあるとき、有効とします。
ii）エンドトキシン濃度：A液の希釈系列において、陽性を示す最大の希釈倍数をエンドポイントとし、λ
にエンドポイントにおける希釈倍数を乗じて得た値をA液のエンドトキシン濃度とします。A液の2回の
試験結果より、幾何平均エンドトキシン濃度を求めます（幾何平均エンドトキシン濃度は、１．予備試
験
ライセート試薬の表示感度確認試験の計算式を準用して求めます）
。
ii）−1．A液の希釈系列の中に陽性を示すものがないとき、A液のエンドトキシン濃度はλにA液の最小希
釈倍数を乗じた値未満とします。
−2．A液の希釈系列のすべてが陽性のとき、Ａ液のエンドトキシン濃度は、λにＡ液の最大希釈倍数を
ii）
乗じた値以上とします。
iii）Ａ液の平均エンドトキシン濃度から、被験試料のエンドトキシン濃度（EU/mL、EU/mg、EU/mEｑ
またはEU/単位）を算出します。
被験試料のエンドトキシンの濃度は（EU/mL、EU/mg、EU/mEｑまたはEU/単位）が、医薬品各条に規定
されたエンドトキシン規格を満たすとき、被験試料はエンドトキシン試験に適合します。
21
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
Ⅱ
2
ゲル化法における予備試験、限度試験法および定量試験法の標準操作法
λ：0.03EU/mLのライセート試薬（マルチテストおよびシングルテスト）ならびに試料溶液を10倍希釈液
で用いる操作法を示します。
1. 標準操作法例
1）
エンドトキシン標準溶液
［0.06(2λ)、0.03(1λ)、0.015 (0.5λ)、0.0075EU/mL(0.25λ)］
の調製
日本薬局方エンドトキシン100標準品
（JPRSE100）
に100EU/mLとなるようにエンドトキシン試験用
水を加えて試験管ミキサーで2分間激しく混合し、溶解します。次に氷冷下で、下図のように希釈（各希釈
段階では、各々1分間混合）し、ライセート試薬の表示感度確認試験ならびにC液用のエンドトキシン標準
溶液を調製します。
エンドトキシン標準溶液
（2λ∼0.25λ）
調製例
（ライセート試薬の表示感度試験ならびにＣ液用）
0.1mL
0.1mL
0.4mL
2.4mL
1.8mL
1.8mL
1.8mL
JPRSE
100EU/mL
エンドトキシン試験用水（mL）
エンドトキシン濃度（EU/mL）
0.9
10
0.9
1
3.6
0.1
1.6
0.06
（2λ）
1.8
0.03
（λ）
1.8
1.8
0.015
0.0075
（0.5λ）（0.25λ）
2）
その他の試料溶液の調製
Ａ液の調製
0.6mL
0.6mL
0.6mL
0.6mL
試料原液
エンドトキシン試験用水（mL） 5.4
試料原液希釈倍数
10×1
0.6
10×2
0.6
10×4
0.6
10×8
22
ENDOTOXIN
B液の調製
試験溶液での希釈
0.25mL
0.1EU/mL
エンドトキシン標準溶液
1.5mL
試料原液
エンドトキシン試験用水（mL）
エンドトキシン濃度（EU/mL）
1.0mL
10倍希釈試料溶液
エンドトキシン濃度（EU/mL）
0.75
0.06
（2λ）
1.0mL
1.0
0.03
（λ）
1.0mL
1.0
0.015
（0.5λ）
D液
（1.0mL準備）
エンドトキシン試験用水
23
1.0
0.0075
（0.25λ）
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
2. 測定法例
１）
ライセート試薬の準備
予備試験および限度試験（計54本準備）
予備試験：ライセート試薬の表示感度確認試験 16本
反応干渉因子試験 30本
限度試験： 8本
定量試験法： 20本
パイロテル®
［マルチテスト］
［シングルテスト］
エンドトキシン試験用水
5mL
使用前に静かに混合します。
数分で溶解します。
バイアルの蓋を取り、
アルミキャップをかぶせます。
2）
検体等の添加
［マルチテスト］
［シングルテスト］
検体等（A∼D液）の0.1mLずつをチップで分注した後、
溶解したパイロテル®の0.1mLずつをシリンジ等で添
加します。
パイロテル®
0.1mL
検体等（A∼D液）の0.2mLずつをチップで添加し
ます。
0.1mL
0.2mL
検体等
（A∼D液）
パイロテル溶液
24
ENDOTOXIN
3）
加温
アルミキャップで蓋をし、試験管ミキサーで1∼2秒間混合します。（または、20∼30秒間試験管立て
を振って、よく混合します。）ドライブロック等の恒温槽で37（±1）℃で60（±2）分間静置します。加温中
は振動を与えないように注意して下さい。
4）
転倒
恒温槽より静かに取り出し180°転倒させます。
5）
判定
（ゲル化法）
陽性：180°
転倒してもゲルが崩れません。
25
陰性：180°
転倒するとゲルが落ちる
またはゲルが形成されません。
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
Ⅲ
ウェルリーダーの設定条件
1. カイネティック比色法
（反応速度法）
①Meas Parameter
②Select Mode
2. エンドポイント比色法
①Meas Parameter
②Select Mode
26
ENDOTOXIN
3. カイネティック比濁法
（反応時間法）
①Meas Parameter
②Select Mode
4. 検量線
（Select Curve）
①実数プロット
27
②対数プロット
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
Ⅳ
EGリーダーSV-12の設定条件
1. カイネティック比色法
（反応速度法）
①Parameter
（実数プロット）
②Parameter
（対数プロット）
28
ENDOTOXIN
製品一覧
Code
品名
包装
定価
［試薬］
Code
品名
包装
定価
800817 バイアル瓶立（26mm、9本）
1個
3,500円
900470 ホットプレートCT-961アルミブロック
（標準）
1個
26,000円
900476 ホットプレートCT-961アルミブロック（φ10−16.5mm×45mm）加工料
1件
40,000円
1セット
196,000円
010022 Control Standard Endotoxin
1本
7,000円
010023 USP Reference Standard Endotoxin
1本
33,100円
010040 トキシカラー DIAセット
60回用
8,000円
900500 ホットプレートCT-961
010140 トキシカラー® DIA-MPセット
100回用
8,000円
900510 トキシペットディスペンサー
1個
33,000円
®
1本
18,000円
900513 トキシペットサンプラー10
1個
25,000円
®
010215 パイロテルマルチテスト
（0.06EU/mＬ）
1本
17,500円
900515 トキシペットサンプラー100
1個
25,000円
010220 パイロテル®マルチテスト
（0.125EU/mＬ）
1本
17,000円
900516 トキシペットサンプラー200
1個
25,000円
010230 パイロテル®シングルテスト
（0.03EU/mＬ）
900517 トキシペットサンプラー1000
1個
25,000円
®
010210 パイロテルマルチテスト
（0.03EU/mＬ）
10本
12,000円
®
10本
10,000円
®
10本
10,000円
900602 ウェルリーダーSK603ソフトパッケージ XP-タイプ
1セット
90,000円
®
1本
18,000円
900603 ウェルリーダーSK603ソフトパッケージXP-タイプセキュリティーユニット
1セット
120,000円
1セット
18,000円
900611 生物活性定量法ソフトPS203XP
1セット
350,000円
010240 パイロテルシングルテスト
（0.125EU/mＬ）
010245 パイロテルシングルテスト
（0.25EU/mＬ）
010250 パイロテル -T
®
010260 パイロクロム
®
010270 パイロソル pHインジケータ入り
（ゲル化法用）、5.5mL
［測定装置、関連製品］
5本
10,000円
900613 エンドトキシン試験法 EDTR14/XP
1セット
70,000円
®
5本
10,000円
900614 エンドトキシン試験法 EDTT14/XP
1セット
70,000円
®
1本
10,800円
900615 エンドトキシン試験法 EDTE14/XP
1セット
70,000円
1本
16,000円
900630 EGリーダーSV-12
1台
980,000円
10本
10,000円
900636 SV-12光源ランプ
1本
12,000円
020055 エンドトキシン標準品 CSE-Lセット
1セット
10,000円
900637 吸光度校正用NDフィルター
1セット
120,000円
020056 エンドトキシン標準品 CSE-Hセット
1セット
10,000円
900638 追加トレーサビリティ証明（EGリーダーSV-12）
1波長
15,000円
®
1波長
15,000円
010271 パイロソル pHインジケータ無し、5.5mL
010272 パイロソル pHインジケータ無し、55mL
TM
010280 パイロターブ
ES
010290 LRW
020130 トキシカラー LS-50Mセット
1セット
18,000円
900639 NDフィルター校正点検
®
1セット
28,000円
900640 ウェルリーダーSK603
1台
1,700,000円
®
1セット
33,000円
900641 フィルター450nm
1枚
60,000円
［乾熱滅菌済器具、
あるいはエンドトキシン、
（1→3）-β-D-グルカンフリー器具］
900642 フィルター570nm
1枚
60,000円
800799 乾熱滅菌試験管（10×75mm）
5本×20
9,800円
900643 フィルター660nm
1枚
60,000円
800801 乾熱滅菌試験管（12×105mm）
5本×10
4,800円
900645 キャリブレーションプレート
（OPC2000型）
1セット
160,000円
800804 乾熱滅菌アルミ箔
10枚×10
1,500円
900646 追加トレーサビリティ証明（ウェルリーダーSK603）
1波長
15,000円
800807 乾熱滅菌アルミキャップ
20個×5
9,600円
900647 キャリブレーションプレート校正点検
1波長
15,000円
800820 イージーチューブⅡ
（S）
50本
13,000円
900648 IQ/OQ手順書
一式
150,000円
900520 トキシペットディスペンサー用シリンジ
（3mL）
50本
24,000円
900649 IQ/OQ作業料金（手順書付）
一式
240,000円
900540 トキシペットチップ200
500本
25,000円
900651 フィルター405nm
1枚
45,000円
900545 トキシペットチップ1000
100本
15,000円
900652 フィルター492nm
1枚
45,000円
900570 トキシペットプレートLP
50枚
29,000円
900653 フィルター545nm
1枚
45,000円
900654 フィルター630nm
1枚
45,000円
900656 SK603光源ランプ
1本
15,000円
020150 エンドスペシー ES-50Mセット
020170 エンドスペシー ES-24Sセット
［非滅菌器具］
800815 試験管立（11mm、50本）
1個
3,500円
800816 試験管立（14mm、50本）
1個
3,500円
29
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
MEMO
30
発売元
機能化学品営業部
〒100-0005 東京都千代田区丸の内一丁目6-1
Telephone:03-5220-8953
Facsimile :03-5220-8956
E-Mail : [email protected]
URL : http: / / www.seikagaku.co.jp/
2005.8.1.3T（MP）
E

Download Report