KATI YÜZEY VĐTRĐFĐKASYON VE KLASĐK VĐTRĐFĐKASYON TEKNĐKLERĐNĐN ĐN VĐTRO ELDE EDĐLMĐŞ ĐNEK BLASTOSĐST CANLILIK ORANLARI ÜZERĐNE ETKĐSĐ Tolga AKKOÇ1, Ali Cihan TAŞKIN1 , Sezen ARAT1, Haydar BAĞIŞ1,2 1 TÜBĐTAK MAM Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Enstitüsü (GMBE), Gebze/Kocaeli 2 Adıyaman Üniversitesi Tıp Fakültesi. Adıyaman Bu çalışma TÜBĐTAK KAMAG-106G005 No’lu proje tarafından desteklenmiştir Đletişim: Doç.Dr.Sezen ARAT ([email protected]) Đnek blastosistlerinin kriyoprezervasyonu transgenik teknoloji, klonlama ve gen bankası çalışmalarını kapsayan kriyobiyoloji alanındaki araştırmalarda önemli yer tutmaktadır. Çalışmanın amacı, Katı Yüzey Vitrifikasyon (SSV) ve Klasik Vitrifikasyon Tekniklerinin in vitro üretilmiş inek blastosistlerinin canlılıkları üzerine etkilerinin araştırılmasıdır. Çalışmada sığır oositlerinin in vitro ortamda maturasyonu ve önceden dondurularak saklanmakta olan boğa spermaları ile fertilizasyonundan sonra gametlerin in vitro kültürleri ticari kültür medyumunda blastosist safhasına ulaşana kadar gerçekleştirilmiştir. Kültür koşulları; gametlerin 72 saat boyunca Quins Advantage Cleavage Medyumu (QACM)(8mg/ml BSA-FAF) sonra ikincil medyum olan Quins Advantage Blastocyst Medyumuna (QABM)(4mg/ml BSA-FAF+%5FCS) transfer edilerek gerçekleştirilmiştir. Çalışmada iki farklı vitrifikasyon tekniği ile blastosistler dondurulmuştur. Birinci grupta blastosistler SSV tekniği ile vitrifiye edilmiştir. Blastosistler, %4 EG içeren TCM199+HEPES+%20FCS medyumunda 12 dakika ekilibre edilmiş sonra %35 EG,%5 PVP40,0,4M Trehalose içeren vitrifikasyon medyumuna transfer edilip 30 saniye bekletilerek 3-4 adet blastosist gruplar halinde önceden soğutulmuş -150 ºC’deki metal yüzeye bırakılmışlardır. Çözündürme işlemi vitrifiye olmuş damlaların 0,3M Trehalose içeren çözündürme medyumuna transfer edilerek 3 dakika süre bekletilerek gerçekleştirildi. Çözündürülen blastosistler 1 gün boyunca QABM medyumunda kültür edilmiştir. Đkinci grupta blastosistler klasik vitrifikasyon yöntemiyle vitrifiye edilmiştir. Blastosistler artan molaritelere sahip kriyoprotektan madde içeren vitrifikasyon solüsyonlarına VS1,VS2,VS3 sırasıyla 5,5 ve 1’er dakika süre ile maruz bırakıp payete çekilip sıvı azot daldırılarak vitrifiye edildiler. Çözündürme işleminde payet 20 ºC’deki su banyosuna daldırıldı ve payetin içeriği 0,5M ve 0,25M Sükroz içeren çözündürme solüsyonunlarına sırasıyla 5’er dakika maruz bırakılarak gerçekleştirilmiştir. Çözülen blastosistler TCM-199+%20FCS içeren kültür medyumunda 1 gün boyunca kültür edilmişlerdir. Kontrol grubunda vitrifiye edilmemiş blastosistler kullanılmıştır. Birinci grup blastosistlerin canlılık oranı %87 (13/15), ortalama hücre sayısı 125, Đkinci grup blastosistlerin canlılık oranı %23 (3/13), ortalama hücre sayısı 149, Kontrol grubu blastosistlerin canlılık oranı %100 (10/10), ortalama hücre sayısı 232 olarak tespit edilmiştir. SSV tekniğinde vitrifiye edilmiş blatosistlerin canlılık oranı klasik vitrifikasyon tekniği ile vitrifiye edilmiş blastosislere göre yüksek olmakla birlikte ortalama hücre sayıları bakımından klasik vitrifikasyon tekniği, SSV tekniğine göre daha iyi sonuç vermiştir. SSV grubu ile Kontrol grubu arasında anlamlı fark bulunmuştur. (Mann Whitney Test P<0.05 THE EFFECT OF SOLID SURFACE VITRIFICATION AND CLASSIC VITRIFICATION TECHNIQUE ON SURVIVE RATE OF IN VITRO PRODUCED BOVINE BLASTOCYST Tolga AKKOC1, Ali Cihan TASKIN1 , Sezen ARAT1, Haydar BAGIS1,2 1 TUBITAK MAM- Genetic Engineering and Biotechnology Institute (GEBI), Gebze/Kocaeli 2 Adiyaman University and Medical Faculty. Adiyaman This study was supported by TUBITAK (Project No. KAMAG-106G005) Contact: Assoc. Prof. Sezen ARAT ([email protected]) Cryopreservation of bovine blastocyst is important for cryobiology researches included transgenic technology, cloning and gene banking studies. The purpose of the study was to compare the Solid Surface Vitrification(SSV) and Classic Vitrification Techniques on survivability of in vitro produced bovine blastocyst. In this study bovine oocytes were in vitro maturated and fertilized with frozen bull semen than cultured until blastocyst stage in commercial culture medium. After fertilization, gametes were cultured in Quins Advantage Cleavage Medium (QACM)(8mg/ml BSA-FAF) for 72h and in Quins Advantage Blastocyst Sequental Medium(QABM)(4mg/ml BSA-FAF+%5FCS) for additional 4 days. Blastocysts were vitrified with two different vitrification techniques. First Group blastocyst vitrified with SSV techniques. They equilibrated 4%EG in basic medium (TCM-199+HEPES)+20%FCS for 12 min. Than they exposed to vitrification medium contains 35%EG, PVP40 5%, 0.4 M Trehalose for 30 sec. After that 3-4 blastocyst were vitrified by dropping blastocysts onto precooled -150 ºC metal surface. Warming was performed by transferring vitrified drops into warming solution that contains 0,3M.Trehalose for 3 min. Thawed blastocyst were cultured in QABM for 1 day. Second Group blastocyst vitrified with Classic Vitrification Techniques. They exposed to Vitrificaiton Solution VS1,VS2 and VS3 included increasing molarities cryoprotectant for 5,5 and 1 min. respectively and loaded into straws than plunged into liquid nitrogen. Warming was performed by plunging straws into 20ºC water bath and washing blastocysts in warming solution included 0,5 M and 0,25 M Sucrose for 5,5 minutes respectively. Thawed blastocysts were cultured in TCM-199+20% FCS for 1 day.Unvitrified blastosist were used for control group. First group blastocysts viability rate was 87% (13/15), median cell number was 125.In second group blastocysts viability rate was 23% (3/13), median cell number was 149. Control group blastocysts viability rate was 100% (10/10), median cell number was detected 232. It’s observed that blastocysts viability rate in SSV Techniques was higher than Classic Vitrification Techniques although total cell number seems higher in Classic Vitrification Techniques than SSV Technique. There was a significant differences between SSV Technique and Control Group. (Mann Whitney Test P<0.05).