平成27年度福井県立高志高等学校ＳＳＨ『理数科課題研究報告書』根粒菌の効果的な増殖について Effects of root nodule bacteria on the growth of plants 川端友希島田まりあ野坂正明 Tomoki Kawabata Maria Shimada Masaaki Nosaka Abstract Bacteria called rhizobia gives nutrients to the soil. And if it is possible to produce them efficiently, we can change the soil which has no nutrients to the soil with nutrients. We study a method that can efficiently produce rhizobia. 要約根粒菌はマメ科植物の根に共生し、空気中の窒素を取り込み、植物の栄養分に必要不可欠なアンモニアを合成する。根粒菌が多ければ、もともと栄養分の少ない土地でも植物を育てられると考え、根粒菌を効果的に増殖させる方法について調べた。発根したシロツメクサの根に、市販の種子粉衣剤の「まめぞう」および根粒から抽出した根粒菌を接種し、根粒の着生数への影響を調べた結果、すべての区画において根粒の着生はみられなかった。また「まめぞう」および根粒菌抽出液をそれぞれシロツメクサの種子に接種し、根の伸長と根粒の着生数とを比較した結果、まず根が伸長し、その後根粒が着生すると考えられる。次に、NAA を加えた培地に根粒菌抽出液をシロツメクサの種子に接種したものを無菌播種し、NAA が根の伸長に与える影響を調べた結果、根の伸長はホルモンフリーと根粒菌抽出液の組み合わせが最も大きかった。はじめに (2)培地条件素寒天培地、ジェルライト 2ｇ/L を加えたムラシゲ・スクーグ培地にスクロース 30ｇ/L を添加したものと、無添加のものの 3 種類を 25 本ずつ、計 75 本用意した。 (3)培養条件明期 16 時間、暗期 8 時間に設定した 23℃の培養器内で行った。ゲンゲやダイズなど多くのマメ科植物は、緑肥として広く使われている。マメ科植物では、共生している根粒の中で根粒菌が窒素固定を行い、土地が肥沃になる。そこで、シロツメクサを使って痩せた土地を肥沃な土地に変えることが出来ないかを考えた。まずシロツメクサの種子を無菌播種し、どの培地が発根に適しているかを調べた。また発根した根に市販の種子粉衣剤の「まめぞう」および根粒から抽出した根粒菌をそれぞれ接種し、根粒の着生数への影響を調べた。さらに「まめぞう」および根粒菌抽出液をそれぞれシロツメクサの種子に接種し、根の伸長と根粒の着生数との関係を調べた。Ｂ.結果ムラシゲ・スクーグ培地はスクロースを添加したものと無添加のもののどちらもコンタミネーションを起こした。素寒天培地は播種後 2 日後から発根したが、6 日後から伸長が止まった。Ｃ.考察ムラシゲ・スクーグ培地がコンタミネーションを起こした理由は、殺菌が不十分でシロツメクサの種子の内部に侵入した細菌が増殖したからだと考えられる。また素寒天培地が播種 6 日後から伸長が止まった理由は、6 日目までは種子内の栄養分によって伸長したが、それ以降は栄養分がなくなったため、伸長が止まったと考えられる。実験Ⅰ 無菌播種における各培地の影響シロツメクサの種子を無菌播種する際に、素寒天培地および、ムラシゲ・スクーグ培地にスクロースを添加したものと無添加のものの 3 種類の培地では、どの培地で根が育ちやすいかを調べた。実験Ⅱ Ａ.材料および方法 (1)植物材料園芸店で購入したシロツメクサの種子を用いた。根粒菌の接種による根粒の着生数への影響発根したシロツメクサの根に「まめぞう」および根粒菌抽出液を接種したものをグロスポーチ内で培養し、根粒の着生数を調べた。 34 平成27年度福井県立高志高等学校ＳＳＨ『理数科課題研究報告書』Ａ.材料および方法 (1)植物材料無菌播種により発根させたシロツメクサの根を用いた。 (2)培地条件キムタオルをハイポネックス希釈液(5000 倍) に浸し、発根したシロツメクサの根に蒸留水、「まめぞう」、根粒菌抽出液をそれぞれ接種した。 ①ハイポネックス希釈液＋蒸留水 ②ハイポネックス希釈液＋「まめぞう」水溶液 ③ハイポネックス希釈液＋根粒菌抽出液 (3)培養条件実験Ⅰと同様の条件で行った。Ｂ.結果図１根の伸長については、実験区①③で 11 日目以降、根の伸長が緩やかになった。実験区②は実験区①③に比べて根の伸長が大きく、17 日目以降も根の伸長が見られた。(図１) Ｂ.結果写真１すべての区画において、根粒の着生はみられなかった。(写真１) 図２Ｃ.考察根粒を乳鉢ですりつぶした抽出液を用いたが、ハイポネックス希釈液により根粒菌の濃度が低下したため、根粒が着生しなかったと考えられる。実験Ⅲ 根の伸長と根粒の着生数との関係写真２写真３根粒の着生数については、実験区①は根粒が着生せず(写真２)、実験区②は 14 日目から根粒の着生がほとんどなくなった。実験区③は 9 日目から根粒が着生しなくなったが、14 日目以降、また根粒の着生数が増加した。(写真３)(図２) 「まめぞう」および根粒菌抽出液を、それぞれシロツメクサの種子に接種したものを無菌播種し、根の伸長と根粒の着生数との関係を調べた。Ａ.材料および方法 (1)植物材料園芸店で購入したシロツメクサの種子を用いた。 (2)培地条件素寒天培地を基本培地とし、シロツメクサの種子を次の各溶液に浸して無菌播種したものを 20 本ずつ用意した。 ①蒸留水 ②「まめぞう」水溶液 ③根粒菌抽出液 (3)培養条件実験Ⅰと同様の条件で行った。Ｃ.考察根の伸長は実験区②が良く伸びているが、これは「まめぞう」に含まれるアゾスピリラム菌が植物ホルモンであるオーキシンを合成し、それが根の伸長を促進したためだと考えられる。また根粒が着生した 11 日目以降、実験区①③は根の伸長が緩やかになったことから、まず根がある程度伸長し、次に根粒の着生が起こると考えられる。 35 平成27年度福井県立高志高等学校ＳＳＨ『理数科課題研究報告書』実験Ⅳ 植物ホルモンと根粒菌が根の伸長に与える影響れる。また、根粒菌は無機塩類の存在下では、根の伸長を促進させるはたらきがあると考えられる。根の伸長を促進する植物ホルモン NAA を加えた培地に、根粒菌抽出液をシロツメクサの種子に接種したものを無菌播種し、NAA と根粒菌が根の伸長に与える影響を調べた。今後の課題 NAA の濃度を低濃度に設定し、シロツメクサの根の伸長における NAA の最適濃度を調べたい。また、他の植物ホルモンについても、根の伸長に対する最適濃度を調べたい。Ａ.材料および方法 (1)植物材料園芸店で購入したシロツメクサの種子を用いた。 (2)培地条件ジェルライト 2ｇ/L を加えたムラシゲ・スクーグ培地を基本培地とし、次の各濃度の NAA を加えたものを用意し、シロツメクサの種子を蒸留水および根粒菌抽出液に浸して無菌播種したものを 10 本ずつ用意した。 ① ② ③ ④ NAA ﾎﾙﾓﾝﾌﾘｰ蒸留水 ⑤ NAA NAA 0.1μ molℓ 蒸留水 ⑥ NAA NAA 1μ molℓ 蒸留水 ⑦ NAA NAA 10μ molℓ 蒸留水 ⑧ NAA 謝辞本研究を進めるに当たり、京都学園大学バイオ環境学部の大城閑教授より多くのご助言とご教示をいただいた。心から御礼申し上げる。ﾎﾙﾓﾝﾌﾘｰ根粒菌 0.1μ molℓ 根粒菌 1μ molℓ 根粒菌 10μ molℓ 根粒菌 (3)培養条件実験Ⅰと同様の条件で行った。Ｂ.結果図３根の伸長については、実験区⑤の伸長が最も大きく、次に実験区①②⑥の伸長が大きかったが、その他の実験区では根の伸長はほとんど見られなかった。(図３) また、すべての実験区において根粒の着生はみられなかった。Ｃ.考察オーキシン系植物ホルモンである NAA は、高濃度では根の伸長を阻害する。この結果から NAA の最適濃度は 0.1μmol より低濃度であると考えら 36