26/03/14 13. I cromosomi contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale Le dimensioni dell’acido nucleico è molto maggiore delle dimensioni del compartimento in cui è contenuto 1 26/03/14 Ogni cellula con,ene circa 2 metri di DNA Diametro nucleo = 5 – 8 μm Come organizzare il DNA? Il DNA nucleare si distribuisce nei CROMOSOMI 3,2 x 109 coppie di nucleo2di distribuite in 24 cromosomi 2 copie di ogni cromosoma (DIPLOIDE) 1 dal padre 1 dalla madre: CROMOSOMI OMOLOGHI cellule germinali (uova e spermi) 1 copia: -‐ CROMOSOMA X dalla madre -‐ CROMOSOMA Y dal padre OGNI COPPIA DI CROMOSOMI CONTIENE UN CROMOSOMA DI ORIGINE PATERNA E UN CROMOSOMA DI ORIGINE MATERNA I cromosomi sono presenti in coppie nelle cellule somatiche e i membri di una coppia sono i cromosomi omologhi. Se una cellula contiene 2 cromosomi di ogni tipo , cioè due serie di cromosomi, si dice che possiede un corredo cromosomico diploide; Se è presente un cromosoma di ogni coppia di omologhi, si dice che il corredo è aploide. Nell’uomo il numero diploide è 46 e il numero aploide è 23 2 26/03/14 Nell’uomo 23 coppie di cromosomi = 22 coppie di cromosomi somatici non sessuali (autosomi) + 1 coppia di cromosomi diversi, i cromosomi sessuali (eterosomi) quoziente di compaDamento (rapporto di impaccheDamento) rapporto tra la lunghezza del DNA e la lunghezza dell’unità che lo con,ene. per es. il più piccolo cromosoma umano: cromosoma mito,co = 7 DNA 4,6x 10 bp = quoziente di compaDamento = 2 µm 1,4 cm 7000 3 26/03/14 compa?amento differenze tra genoma cellulare e virale • genoma cellulare ha dimensioni indefinite: numero sequenze varia a seconda della duplicazione, delezione o riarrangiamento Richiede metodo generalizzato per compattare il DNA che non contenuto totale • genoma virale La quantità di ac nucleico da compattare è predeterminata Deve adattarsi all’interno di un rivestimento assemblato Impacche?amento del genoma virale Il genoma è contenuto dentro un CAPSIDE deve essere sufficientemente grande per racchiudere il genoma virale Volume interno capside ≈ V genoma come risparmio di informazione genetica , deve essere formato da un numero limitato di specie proteiche le subunità proteiche devono interagire tra loro in maniera da mantenere rapporti identici i capsidi devono avere struttura simmetrica 4 26/03/14 SIMMETRIA DEI CAPSIDI strutture chiuse composte da subunità identiche che interagiscono attraverso interazioni specifiche possono avere 3 tipi di simmetria: tetraedrica cubica icosaedrica 4 facce triangolari 6 facce quadrate 20 facce triangolari (12 subunità) (24 subunità) (60 subunità) La simmetria icoasedrica è la più efficiente. Anche se prevede un n° maggiore di subunità, le subunità possono essere di piccole dimensioni necessità di minore informazione genetica 9 Due possibilità: • Il rivestimento proteico si assembla intorno all’acido nucleico: VIRUS a RNA • L’acido nucleico viene inserito dopo che il capside si è formato: VIRUS a DNA 5 26/03/14 VIRUS a RNA La posizione dell’RNA è determinata dal suo attacco alle proteine del guscio Capside formato da un disco a + strati che forma un elica quando interagisce con l’RNA VIRUS a DNA guscio della testa pieno convertito in guscio vuoto che poi incorporerà il DNA 6 26/03/14 Inserzione del DNA comporta 2 tipi di reazioni: - condensazione - traslocazione: DNA spinto nella testa con meccanismo ATP dipendente molti virus si replicano con un meccanismo a cerchio rotante che genera lunghe code NB cos perchè taglio genera estremità coesive Impacche?amento del genoma ba?erico Materiale genetico è una massa che occupa 1/3 del V dellla cellula 7 26/03/14 Nucleoide fuoriesce da una cellula lisata di E Coli sotto forma di una fibra avvolta in anse Struttura del cromosoma batterico Domini separati Superavvolgimenti diversi 8 26/03/14 2 tipi di superavvolgimento: - DNA superavvolto libero: percorso NON RISTRETTO - DNA legato a proteine: percorso RISTRETTO Le principali proteine istone-simili del nucleoide batterico Caratteristiche • basica HU • molto abbondante • 30000 copie/cellula • nessun consenso H-NS histone-like nucleoid structuring protein pm (kDa) Geni HU α 9.2-9.5 hupA (90.4 min) HU β 9.5 hupB (9.9 min) omodimero 2 x 15.5 hns (27.8 min) Struttura • compatta il DNA in strutture nucleosoma-simili eterodimero • 20000-40000 copie/cellula • induce curvatura nel DNA • riconosce DNA curvo • interviene nella ricombinazione generale • induce curvatura nel DNA • neutra • aumenta in fase stazionaria Funzioni • nesun consenso • riconosce DNA curvo • è un repressore trascrizionale • influenza la ricombinazione • basica • aumenta in funzione del IHF integration Host Factor ciclo cellulare • 5-10 volte meno abbondante di HU eterodimero IHF α • induce forte curvatura (fino a 140°) nel DNA IHF β 11.2 10.5 himA (38.6 min) himD (25 min) omodimero 2 x 11.5 fis (73.4 min) • interviene nella ricombinazone sito-specifica e • nella trasposizione • debole specificità di sequenza (YA N T GATW) 2 4 2 • basica FIS Factor for inversion stimulation • induce curvatura (fino a 90°) nel DNA • abbondante in fase esponenziale • 10000-60000 copie/cellula • scarsa specificità di sequenza (KN YRN WN YRN M) 2 2 2 2 • è un regolatore trascrizionale • interviene nella ricombinazone sito-specifica e • nella trasposizione 9 26/03/14 DNA eucariotico ha anse e domini attaccati ad un impalcatura Cromosomi privati istoni Il DNA si lega all’impalcatura a livello di specifiche sequenze: Matrix Attachment Regions (MAR) o Scaffold Attachment Regions (SAR) 1. Analisi delle MAR esistenti dopo taglio con nucleasi solo le sequenze MAR presunte restano attaccate alla matrice isolamento matrice nucleare 1 2 2. Rimozione di tutto il DNA e controllo dei frammenti per la loro capacità di legarsi alla matrice MAR - per il 70 % coppie A-T - hanno sito riconoscimento per topoisom II è riesce anche a cambiare il DNA? 10 26/03/14 Nei cromosomi c’è un singolo duplex di DNA molto lungo ripiegato in una fibra che percorre tutto il cromosoma Coppia di cromatidi fratelli in metafase I cromosomi sono una forma condensata di cromatina, complesso di DNA e proteine La cromatina si può dividere in 2 tipi di materiale: EUCROMATINA fibre meno densamente compattate rispetto al cromosoma mitotico (dispersa nel nucleo) ETEROCROMATINA fibre molto compattate (per lo più in corrispondenza dei centromeri) Tramite un microscopio ottico le fibre di cromatina sono distinguibili Le stesse fibre passano senza interruzione da eu ad etero: sono stadi diversi di condensazione del materiale genetico 11 26/03/14 Eucromatina: regioni cromosomiche non condensate, attivamente trascritte e ad alta densità genica Eterocromatina: nucleosomi maggiormente ravvicinati e avvolti ad elica. corrisponde all’80% del DNA nucleare e si presenta sotto forma di zolle molto dense. segmenti di cromosomi che rimangono condensati dopo la mitosi porzioni di DNA geneticamente inattive, in quanto non vengono trascritte. superstruttura a solenoide, contiene poco RNA, è molto ricca in istoni di tipo H1 L’Eterocromatina esiste sotto due forme Eterocromatina costitutiva: struttura ripetitiva, priva di valore genico, che quindi non codifica rappresenta segmenti identici di cromosomi che conservano, durante tutto il ciclo cellulare, un aspetto condensato (ex: braccio lungo del cromosoma Y umano) Eterocromatina facoltativa: in grado di trasformarsi in eucromatina, ossia in cromatina attiva I geni sono repressi (NB la completa inattivazione di un segmento di cromosoma NON porta alterazione struttura genica). Le sequenze di geni repressi sono diverse da un tipo cellulare all’altro e, a seconda del tipo cellulare, i geni che si esprimono non sono sempre gli stessi: questo meccanismo sta alla base della differenziazione cellulare. 12 26/03/14 Dal greco chroma = colore soma = corpo i cromosomi sono infaR colora, da sostanze apposite e sono visibili al microscopio (IBRIDAZIONE). Bandeggio dei cromosomi vengono colora, dopo un par,colare traDamento dei cromosomi stessi o delle cellule da cui sono prepara, Ogni cromosoma assume il colorante in modo caraDeris,co e perfeDamente riproducibile determinando la formazione di regioni scure alternate a regioni chiare: le bande cromosomiche 13 26/03/14 Bandeggio G Tra?amento con tripsina Colorazione con Giemsa Bandeggio R (Reverse) Tra?amento ad alta temperatura Colorazione con Giemsa Giemsa ha affinità per le regioni ricche in basi AT (bande scure) Le bande R sono chiare, deDe G-‐nega,ve, opposte alle bande scure G I geni si concentrano nelle regioni ad alto contenuto di G-C: nelle interbande Ogni banda ha circa 10^7 bp e può contenere molti geni Braccio corto p (petite) Braccio lungo q 14 26/03/14 La posizione del centromero permette di classificare i cromosomi in 4 tipi: A) B) C) D) acrocentrici : centromero in posizione terminale telocentrici: centromero in posizione subterminale submetacentrici: centromero in posizione submediana metacentrici: centromero in posizione mediana Posizione centromero Geni che codificano per rRNA 15 26/03/14 Il CARIOTIPO è l’immagine del completo corredo dei 46 cromosomi Come si ottiene? 1. Stimolazione alla divisione cellulare 2. la colchicina blocca la divisione cellulare (o mitosi) nella metafase: nella fase di massima evidenza dei cromosomi 3. in soluzione ipotonica le cellule vengono fatte scoppiare per liberare i cromosomi 4. i cromosomi vengono colorati, osservati al microscopio e fotografati 5. si cercano nelle foto le coppie di cromosomi omologhi e si dispongono in ordine dal più piccolo al più grande. Cariotipo umano di un uomo (presenza cromosoma Y) 16 26/03/14 Se un traDo di cromosoma va perso o si è trasferito su un altro cromosoma, viene rivelato dal cambiamento del bandeggio EX. Coppia di cromosomi 12 di individuo affe>o da atassia ereditaria Uno dei 2 cromosomi è più lungo per aggiunta di un pezzo di cromosoma 4 cromosoma a spazzola: forma di cromosoma particolarmente estesa e con una intensa attività trascrizionale; visibili nella profase meiotica. Cromatidi tenuti insieme in corrispondenza dei chiasmi 17 26/03/14 Le anse sono circondate da ribonucleoproteine contenenti catene nascenti di RNA cromosomi politenici: molto ingranditi; si formano in seguito a vari cicli di replicazione che producono molte copie (anche centinaia) di cromatidi fratelli che rimangono uniti. Bande scure: cromatina inattiva Bande chiare: > attività trascrizionale 18 26/03/14 N tot geni > N bande In ogni banda geni multipli Per visualizzare geni 19 26/03/14 Nei cromosomi politenici si possono visualizzare i siti attivi: Materiale cromosomico viene estruso dall’asse : ANELLI di BALBIANI Cromosoma ha necessità di rilassare la struttura si espande si creano siti dove viene sintetizzato RNA Per essere trascritto il materiale genetico deve essere disperso dal suo solito stato compatto Il cromosoma eucariotico è un dispositivo di segregazione Regione responsabile è il CENTROMERO 20 26/03/14 Cinetocore: Microtubule Organizing Center (MTOC) del cromosoma bande C si ottengono denaturando i cromosomi in soluzione satura di idrossido di bario e colorando con Giemsa Si colora selettivamente l'eterocromatina nelle regioni attorno al centromero (sequenze di DNA ricche in AT) sequenze del centromero sono in genere ripetitive: nei primati motivo principale è serie in tandem ripetitiva di 170 bp Molecola di DNA mancante del centromero NON segrega in modo appropriato 21 26/03/14 Il cromosoma eucariotico è un dispositivo di segregazione Se una sequenza di DNA è responsabile della segregazione Molecole di DNA con questa sequenza devono spostarsi in modo appropriato durante la divisione cellulare isolati dal lievito frammenti di DNA che contengono i centromeri Frammenti CEN conferiscono stabilità Sono intercambiabili tra i cromosomi I centromeri servono solo per attaccare i cromosomi al fuso, non servono per distinguere tra loro i cromosomi - Il centromero lega un complesso proteico Responsabili connessione al microtubulo CDE-II – Cse4p: interazione fondamentale CDE-I – CBF1: non essenziale per funzione cromosoma CDE-III – CBF3: essenziale 22 26/03/14 TELOMERI si trovano all’estremità del cromosoma Conferiscono stabilità Formati da una lunga serie di sequenze brevi ripetute in tandem Formula delle sequenze telomeriche: Cn(A/T)m con n>1 m = 1-4 costituiti da 2 filamenti di DNA, di cui uno è detto filamento sporgente (overhang) perché è più lungo di 12-16 nucleotidi, è ricco in G e termina con un’estremità libera 3’-OH: Filamento sporgente ricco di G-T si estende oltre quello ricco di C-A NB le ripetizioni di TTGGGG scoperte sul protozoo Tetrahymena thermophila sequenza poi dimostrata essere presente, con alcune varianti (GGGTTA), anche in altre specie (funghi, vegetali e mammiferi, uomo compreso) il filamento sporgente può ripiegarsi su sé stesso tramite appaiamenti non Watson-Crick fra residui G-G formando una forcina detta quartetto di G (il quartetto appartiene a ripetizioni ≠). 23 26/03/14 G-quadruplex (o G-tetradi o G4-DNA): legami idrogeno tra quattro guanine (che formano la cosiddetta tetrade) e stabilizzate attraverso la presenza di un catione monovalente (solitamente il potassio) che si dispone al centro della tetrade stessa. Funzione: sembra ridurre l'attività dell'enzima telomerasi, responsabile dell'elongazione dei telomeri, Quale caratteristica del telomero controlla la stabilità dell’estremità cromosomica? (5-10 kb) L’ assenza di estremità libere stabilizza il cromosoma Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 24 26/03/14 L’ansa si forma quando l’estremità 3’ del telomero (TTAGGG)n sposta la stessa sequenza in una regione a monte del telomero Reazione catalizzata dalla proteina che lega il telomero TRF2 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 I telomeri sono sintetizzati da una ribonucleoproteina: la TELOMERASI Usa come primer il 3’-OH del filamento telomerico G-T su uno stampo di RNA Servono solo dGTP e dTTP Dopo l’aggiunta di un’unità ripetitiva il ciclo ricomincia Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 25 26/03/14 Il telomero ha dunque 2 funzioni: 1. Proteggere l’estremità del cromosoma: Qualsiasi tipo di estremità del DNA (ex. Rottura doppioi filamento) diventa bersaglio di meccanismi di riparazione La cellula DEVE saper distinguere il Telomero dagli altri tipi di estremità Funzione svolta grazie alla proteina STn1 che protegge dalla degradazione 2. Consentire l’allungamento del telomero (altrimenti si accorcerebbe ad ogni ciclo di replicazione: la replicazione infatti non può partire dall’ultima base) Funzione svolta grazie alla TELOMERASI che estende appunto il filamento ricco di CA NB Telomerasi sintetizza le singole ripetizioni aggiunte all’estremità dei cromosomi MA NON è in grado di controllarne il numero Altre proteine legano la telomerasi, controllano il suo accesso al substrato e influenzano la lunghezza del telomero Senza un apparato specializzato nella replicazione delle estremità, i telomeri delle cellule somatiche si accorciano gradualmente ad ogni divisione cellulare Perdita materiale genetico 26 26/03/14 I TELOMERI sono necessari per la sopravvivenza Telomeri troppo corti sono indistinguibili da rotture accidentali del DNA, i cromosomi diventano instabili e vanno incontro a mutazione Se telomerasi è mutata Telomeri si accorciano ad ogni divisione cellulare Ex mutazioni nel lievito Perdita di vitalità 27 26/03/14 In telomeri mutati si può avere crossing-over: vari studi hanno dimostrato che la lunghezza dei telomeri e' legata alla longevità i telomeri - sulla cui lunghezza possono influire vari fattori ambientali tra cui stress, fumo, sedentarieta', alimentazione sbagliata - sono divenuti la chiave per misurare l'eta' biologica di un individuo: quando si vuole misurare la vera età di una persona, si usa sperimentalmente la lunghezza dei telomeri delle cellule del sangue prese con un prelievo. mutazione in una porzione di DNA vicino al gene TERC (gia' noto per avere un ruolo nel mantenere la lunghezza dei telomeri) corrisponde a 3-4 anni in piu' sull'eta' biologica di un individuo Anni quindi da agginugere all'eta' della carta d'identita'. 28 26/03/14 Funzioni biologiche dei cromosomi • Perpetuare il materiale genetico durante lo sviluppo di un individuo • corretta replicazione • corretta suddivisione tra le cellule figlie • Rimescolare il materiale genetico tra generazioni successive • ricombinazione meiotica • segregazione degli omologhi RIASSUMENDO: Requisiti strutturali minimi per l’esistenza di un cromosoma DNA si replica a par2re dall’ORIGINE DI REPLICAZIONE in entrambe le direzioni CENTROMERO a>acca i cromosomi al FUSO in modo che si possano separare TELOMERI formano cappuccio che chiude i cromosomi alle estremità 29 26/03/14 I cromosomi eucariotici hanno bisogno dei seguenti elementi non genici, non coinvolti nella regolazione genica, per una corretta replicazione e segregazione: -‐ Origini di replicazione: siti d’assemblaggio dei complessi di replicazione eucarioti: una origine ogni 30-‐40 kb procarioti: una sola origine per cromosoma -‐ Centromeri: siti di assemblaggio del cinetocoro, complesso proteico responsabile della segregazione dei cromosomi replicati (uno per cromosoma) -‐ Telomeri: complessi proteici localizzati alle estremità dei cromosomi, proteggono da ricombinazione e degradazione. La telomerasi completa la replicazione dei terminali. 30 26/03/14 Centromero Consente la corretta segregazione dei cromosomi durante la mitosi e la meiosi appare come una costrizione in un unico punto lungo il cromosoma. Per ogni cromosoma il centromero é sempre nella stessa posizione Nella maggior parte degli eucarioti ad ogni centromero si attaccano molte fibre del fuso Se il centromero é assente il cromosoma NON può attaccarsi al fuso e può solo migrare casualmente durante la divisione cellulare Telomeri Strutture specializzate che si trovano all'estremità dei cromosomi lineari Permettono la replicazione completa del cromosoma Impediscono l'accorciamento progressivo dei cromosomi Il cromosoma senza telomeri é: -‐ instabile: degradato dalle esonucleasi -‐ altamente reattivo: interagisce rapidamente con altre strutture cellulari tra cui i cromosomi: si formano strutture aberranti che non possono essere correttamente distribuite dal fuso mitotico 31 26/03/14 Origini di replicazione Sequenze specifiche associate al punto di inizio della sintesi del DNA riconosciute da proteine che legano e destabilizzano il DNA La destabilizzazione apre il DNA in corrispondenza dell'origine di replicazione Tutti questi elementi sono stati riuniti per costruire un cromosoma artificiale di lievito: YAC (Yeast Artificial Chromosome) CEN: per corretta segregazione Origine della replicazione CEN: per stabilizzare YAC 32
© Copyright 2024 Paperzz