SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE E’ una spettroscopia di emissione, le molecole, eccitate mediante assorbimento di radiazione elettromagnetica, emettono radiazione. Il processo avviene in tempi rapidi (meno di 10-5 s). La sensibilità della spettroscopia di fluorescenza è maggiore rispetto alla spettrofotometria (da 1 a 3 ordini di grandezza). L’applicabilità è limitata a molecole che sono in grado di fluorescere. Lo spettro di fluorescenza è una immagine speculare di quello di assorbimento a l maggiori (spostamento di Stokes). Le linee che si sovrappongono vengono dette di risonanza. Quali molecole emettono fluorescenza? Solo quelle in cui il rilassamento non radiativo ha velocità paragonabili a quelle del processo fluorescente Il rendimento quantico F rappresenta il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti (o n di molecole che emettono su n che assorbono) I composti fluorescenti sono generalmente composti aromatici, F aumenta con il numero di anelli ed il grado di condensazione Una sostituzione sull’anello aromatico provoca non solo una variazione delle l di assorbimento ed emissione ma anche una variazione di F. La rigidità della molecola influenza significativamente F. Molecole più rigide emettono con efficienza maggiore. La fluorescenza diminuisce all’aumentare della temperatura per effetto delle collisioni molecolari. L’intensità di fluorescenza è direttamente proporziona al potere radiante P0 della radiazione incidente F = K’ (P0 – P) per P0 costante F = Kc La proporzionalità diretta viene persa per valori di assorbanza maggiori di 0.05 (90% di trasmittanza) a causa dell’autospegnimento (self-quenching). Generalmente sono a doppio raggio per compensare variazioni di potere radiante; il rivelatore è a 90° rispetto alla cuvetta I metodi in fluorescenza sono più sensibili rispetto a quelli spettrofotometrici perché aumentando la P0 della sorgente o la sensibilità del rivelatore si possono misurare quantità più piccole (in assorbanza no!). I metodi possono essere diretti o indiretti. Questi ultimi basati sullo spegnimento (quenching) di fluorescenza dopo reazione con l’analita. Nei rivelatori fluorimetrici per cromatografia si derivatizza il campione prima della separazione