●総 説● 核移植による動物クローニングの進歩 長嶋比呂志 Database Center for Life Science Online Service これまでに初期胚の細胞あるいは胚由来の培養細胞を核の供与体として,両 生類だけで なくマウス,ウ サギ,ヒ ツジ,ウ シ,ブ タなどの哺乳動物においても核移植が行なわれ,い くつかの動物種では実際に遺伝的背景が均一(identical)なクローン動物集団が作出され ている。さらにヒツジでは培養乳腺細胞からの核移植でも産仔が得られ,動 物細胞の分化 が遺伝子の不可逆的な変化によるものではなく,分 化 した細胞の核が受精卵の核と同様に 完全なゲノムのセットを有するとの概念が証明されるに至った。このブレイクスルーによ り,動 物個体の複製化が可能になるだけでなく,遺 伝子ノックアウト家畜の作出など,こ れまで困難であった高度な動物遺伝子操作への道が開かれるものと期待される。 Key words は じめ に 【ク ロ ー ニ ン グ 】 【 核 移 植 】 【初 期 化 】 【 分化】【 胚】 培 養乳腺 細胞 の核移 植 によ って,ク ロー ン 分 化 した 体 細 胞 は,受 精 卵 に等 し い 同 一 の遺 伝 子 組 成 ヒツジ"ド リー"が 誕 生 した 。 この成 果 に よ り,動 物 を も ち,そ 細 胞 の分化 が遺 伝子 の不可 逆 的 な変化 に よる もので は ら別 々 の 遺 伝 子 を利 用 す る と考 え られ て い る。 ない ことが証 明 された 。核 移植 胚 が正 常 な発達 を遂 げ れ ぞ れ が,共 通 の ゲ ノ ム の セ ッ トの な か か この 仮 説 の検 証 を 目 的 と して,核 ヒ ョ ウ ガ エ ル(Rana の初期 化 は,細 胞質 中の 因子 や,核 と細胞 質 の細 胞周 laevis)を 材 料 と し て 行 な わ れ て き た 。 分 化 した 細 胞 の 期 の関 係 に影響 を受 けることが,両 生類,実 験動 物,家 核 を,核 畜 を対 象 とす る研究 を通 じて 明 らか に され て きた 。 ま 築 し た と き に,も た,培 養体 細胞 の核 移植 に よ る哺 乳動 物 ク ローニ ング の タ イ プ の 分 化 細 胞 が つ く ら れ れ ば,前 法 は,家 畜 の遺 伝子 操 作 の新 時代 を開 くもの と期 待 さ 明 され た こ とに な る。 れ る。 pipiens)や 移 植 の 研 究 は長 年, るため には,移 植 核 が初 期 化 されなけれ ばならない。核 ツ メ ガ エ ル(Xenopus を 除 去 し た 卵 へ 移 植 し て新 しい 受 精 卵 を再 構 1966年,Gurdon1)ら し,そ の卵 が正常 に発生 してす べ て は,ア フ リカ ツメ ガ エ ル の オ タ マ ジ ャ ク シ の 小 腸 上 皮 細 胞 の 核 を,紫 I. 両生類の核移植-分 化細胞核の可逆性の検証 外線 照射 によ っ て 染 色 体 を 破 壊 した 未 受 精 卵 の 細 胞 質 中 に 移 植 し て, 新 た に 受 精 卵 を再 構 築 し た 結 果,そ 細 胞 分 化 は,遺 伝 子 の 不 可 逆 的 な変 化 に よ る の で は な く,遺 伝 子 の 差 次 的 発 現(differential 記 の仮 説 は証 gene expres- す る こ と を示 し た(図1)。 の 卵 が 成 体 に発 生 し か し こ の 研 究 に は,用 い た 核 の中 に始 原生 殖細 胞 が混 入 して いた可 能性 が否 定 sion)に よ っ て起 こ る とい う考 え は,発 生 遺 伝 学 の 中 心 で き な い こ とや,幼 的 な仮 説 で あ る。 す な わ ち,さ 胞 は,分 化 細 胞 の 代 表 例 と し て の適 格 性 に 欠 け る と い ま ざ ま な 形 態,機 能に Hiroshi Nagashima,Department of Obstetricsand Gynaecology,The Development of Animal Cloning by Nuclear Transfer 2522 若 なオ タマ ジ ャク シの小腸 上皮 細 Universityof Adelaide,Adelaide,South Australia 5005,Australia 41 核移植 による動物ク ローニ ングの進歩 た 卵 が オ タ マ ジ ャ ク シ に まで 発 生 しう るこ とが 確 認 され た2)。 これ ら の 結 果 か ら,分 化 した 体 細 胞 核 は,核 移 植 に よ っ て 初 期 化(reprogramming)*1 され,未 分化 な細 胞核 の よう な 多 様 性 を発 揮 し う る こ とが 示 され た。 しか し,分 化 細 胞 核 を 用 い た カ エ ル の核 移 植 卵 の発 生 が, オ タマ ジ ャク シの段 階 まで に と ど ま り,完 全 な 成 体 へ の 発 Database Center for Life Science Online Service 達 例 が 得 ら れ て い な い こ とか ら,分 化 体 細 胞 核 の完 全 な 初 期 化 が 可 能 か 否 か とい う問 題 は,現 在 に至 る ま で 未 解 決 の ままで あ った。 II. 哺乳類 の核 移 植の 黎明 期 -ク ローンマウスの誕生はのち に否定 された カ エ ル で は,胞 胚 の未 分 化 な細 胞 核 を 用 い て 核 移 植 を行 な い,同 一 な遺 伝 的背景 を も つ ク ロ ー ン集 団 を つ く りだ す こ とが で き る。 こ の 手 法 を 哺 乳 動 物 に応 用 し,ク ロー ンマ ウ ス の 作 出 に成 功 した とす る 報 告 が,1981年 にジュネーブ 大 学 のIllmenseeと ン 研 究 所 のHoppeに ジャクソ よっ て Cell誌 上 に発 表 され た3)。 図1 ツ メ ガエ ル の小 腸 上 皮 細胞 核 の 核 移 植 に よ る成 熟 個 体 の作 出 [Gurdon,J.:Sci.Am,,219(6),24(1968)を 改 変] 当 時,こ の ク ロー ンマ ウス 誕 生 の ニ ュ ー ス は,世 界 中 で う問 題 点 が あ り,Gurdonら は さ ら に,成 体 の カエ ル の 水 か き の 上 皮 細 胞 を 培 養 し,そ 植 実 験 を行 な った 。 同 様 に,他 色 細 胞,リ ンパ 球,赤 芽 球,赤 の 細 胞 核 を用 い て 核 移 の研 究 者 に よ って も,黒 血 球,白 血 球 な どの 分 化 細 胞 の 核 を用 い て 核 移 植 実 験 が 行 な わ れ,再 *1 構築 し 生 物 学 上 の 一 大 ブ レイ ク ス ル ー と して受 け 止 め られ,こ の た び の ク ロ ー ン ヒ ツ ジ"ド リー"4)に 劣 ら ぬ,セ ー シ ョナ ル な扱 い を受 けた 。Illmenseeら と,こ の 研 究 で は ドナ ー 核 と して4日 胞 の 内 部 細 胞 塊 細 胞 を 用 い,こ ンセ の発表 による 齢 のマ ウス胚 盤 れ を除 核 し た 受 精 卵 の 細胞核 の分化状 態が発生初期 の受精 卵核 に等 しい未分 化状態 に戻 る こと。 2523 42 蛋 白質 核酸 酵素 Vol.42 No.15(1997) し て 汎 用 さ れ る よ う に な る。 Willadsen(1986年)6)は,こ の 方 法 を修 正 し,ク ロー ニ ン グ つ ま りidenticalな 個 体 集 団 の 作 出 を 目的 と す る ヒ ツ ジ 胚 の 核 移 植 を行 な っ た(図3)。 この 研 究 で は,ド し て8∼16細 ナー核 と 胞期 胚 に由来 す る割 球 が 供 さ れ た の で,理 上 は8∼16個 論 の ク ロ ー ン胚 の 生 産 が可 能 な こ とにな る。実 Database Center for Life Science Online Service 際 に は,1個 図2 IllmenseeとHoppeに [文 献3を の ドナー 胚 か ら, 最 大6個 の ク ロ ー ン胚 が 作 出 され,そ れ らの 移 植 に よ っ て 3頭 のidenticalな 胎仔 が得 ら れ た 。 ま た,1個 の8細 胞期 を核 の ドナ ー とす る ク ロ ー ン よ る ク ロー ンマ ウ ス作 出方 法 改 変] 胚 集 団 の移 植 に よ っ て,identica1な 双 仔 が 誕 生 して い る。 細 胞 質 内 に注 入 した と し て い る(図2)。 し か し な が ら,こ グ は,他 核 移 植 に よ る ク ロ ー ン ヒ ツ ジ の誕 生 以 後,研 の方法 に よるマ ウ スの ク ローニ ン の 研 究 者 に よ る追 試 で 確 認 され る こ とが な く, 最 終 的 に は デ ー タ に捏 造 が あ っ た と して,否 に 至 っ た 。 当 時,多 の1つ は,核 ッ トを,レ 定 され る くの 追 試 が 不 成 功 に終 わ っ た 理 由 は 当 然,他 種 動 物 に も広 げ ら れ,哺 グ の 研 究 は,い っ そ う活 発 に展 開 さ れ る よ うに な った 。 この 時 期 に お け る研 究 の お も な 対 象 は,初 が 得 られ る か と い う点 で あ っ た(表1)。 シ ピエ ン ト卵 の 細 胞 質 中 に 細 胞 膜 を突 き破 物 胚 の 核 移 植 の 基 本 技 術 は,Willadsenの っ て 挿 入 す る と,そ の 卵 が 破 壊 さ れ る とい う 技 術 的 困 Solterは,1983年 に レ シ ピエ ン ト卵 の 細 胞 膜 を 破 る こ と な く核 を 除 去 し,さ ら に セ ン ダ イ ウ イ ル ス を用 い た 期発 生 の ど の 段 階 に まで 進 ん だ 胚 細 胞 か ら,核 移 植 に よ っ て 個 体 の 移 植 お よ び 除 去 の た め の マ イ ク ロ ピペ 難 さ に あ っ た よ うで あ る。 こ れ に 対 し てMcGrathと 究対 象 乳 動物 クロー ニ ン ま た,哺 乳動 発 表後 の数 年 間 に ほ ぼ 確 立 さ れ た と い え る。 核 移 植 に よ っ て 個 体 が 得 ら れ る ドナ ー 核 の ス テ ー ジ が,動 物 種 ご と に 異 な っ て い る の は,核 の初期 化 の起 こ りや す さ とい う,一 種 の 生 物 学 的 ハ ー ドル の 高 さ が 膜 融 合 に よ っ て核 を移 植 す る方 法 を開 発 し,Science誌 そ れ ぞ れ の 種 に よ っ て 違 うた め と説 明 さ れ て い る。 し 上 に発 表 した5)。 この 方 法 はそ の 後,核 か し,ヒ 法 と し て,ク ロ ー ン動 物 の 作 出 に 汎 用 さ れ る よ う に な っ た 。 しか し,最 近 に な っ て,膜 用 い ず に,ド 移 植 の標 準 的 方 融 合(細 胞 融 合)を ナ ー 核 を レ シ ピ エ ン ト細 胞 質 中 に直 接 注 入 す る方 法 も可 能 で あ る こ とが 示 さ れ た の は 皮 肉 な こ ツ ジ や ウ シ に お い て,よ れ て い る の は,こ り多 くの 成 果 が 得 ら れ らの 動 物 種 で は ク ロ ー ン動 物 が つ く ら れ た と き の 産 業 的 イ ンパ ク トが 大 き い た め,よ り 多 くの 研 究 資 源 が 投 じ られ た と い う側 面 も無 視 で き な い よ うに思わ れ る。 とで あ る。 IV. クロー ンウシの生産 と産業的応用 III. 哺乳動物初期胚のクローニ ング 1980年 代 末 か ら90年 代 初 頭 にか けて,能 McGrathとSolterに い る 核 置 換 の 方 法 は,の 2524 よっ て 開 発 され た,膜 融 合 を 用 ち に 哺 乳 動 物 の核 移 植 方 法 と 牛 あ る い は 肉 牛 の 増 産(と す る,ウ 力の高い乳 くに 種 畜 の 増 殖)を 目的 と シの ク ローニ ングの実 用化 研究 が北 米 を中心 43 核移植による動物 クローニ ングの進歩 と して 展 開 され た 。 当 時,北 米 で は す で に,高 能力 のウ シ か ら採 取 し た 胚 を,他 シ の借 り腹(レ の雌 ウ シ ピ エ ン ト) に移 植 して 優 秀 な 遺 伝 形 質 を も っ た 仔 ウ シ を増 殖 させ る 胚 移 植(embryo transfer;ET と も よ ぶ)が 商 業 的 レベ ル で 活 発 に行 な わ れ て い た 。 ウ シ は単 胎 動 物 で,生 数 は 通 常1個 理 的 な排 卵 で あ る が,胚 植 に お い て は,胚 Database Center for Life Science Online Service (embryo 移 の ドナ ー donor)に ホル モ ン 処 置 に よ る過 剰 排 卵 誘 起 を 施 し て,一 度 に平均 して数個 の 胚 を 採 取 し,そ れ ら を数 頭 の レ シ ピ エ ン トに移 植 す る 。 し か し,過 排 卵 処 置 に対 す る反 応 性 に は 個 体 差 が 大 き く,ま た 処 置 を3,4回 反 復 したあ と に は 胚 の 採 取 効 率 は極 端 に低 下 す る の で,そ れ らの 問 題 点 を解 決 す る 方 策 と して,胚 の ク ロ ー ニ ン グ に興 味 が もた れ た ので あ る。 当 時,研 究 を リー ド した, テ キ サ ス 州 の グ ラ ナ ダ ・バ イ オ サ イ エ ン ス 社 で は,最 大11 頭 の ク ロ ー ン ウ シ の 作 出 に成 図3 核 移植 に よ る ヒツ ジ ク ロー ニ ング操 作 [長 嶋 比 呂志:動 物 の 人 工 生 殖,裳 華 房(1990)を 功 した 。 ク ロ ー ン ウ シ集 団 の 改 変] 大 き さ と し て,こ の 記 録 は筆 者 の 知 る限 り い ま だ に 破 られ て い な い。 この 研 究 で は, 表1 核 移植 に よる個 体生 産 が 可能 な ドナー 細胞 の最 も進ん だ発 達 段 階 核 移 植 に よ っ て つ く ら れ た 胚 を 再 度 核 の ドナ ー に 用 い て,次 の サ イ ク ル の 核 移 植 を行 な う と い う 方 法 に よ っ て,数 十 個 の ク ロ ー ン胚 が つ く られ た 。 図4に う に,1個 の8細 移 植 を2回 反 復 す れ ば,理 論 上 は64個 つ く られ る こ と に な る 。 最 近,角 胚 を出 発 材 料(核 復 し,合 計43個 示す よ 胞 期 胚 を核 の ドナ ー として 出 発 す る核 の ドナ ー)と の ク ロ ー ン胚 が 田 ら は1個 し て,核 の桑 実期 移 植 を3回 反 の ク ロ ー ン胚 の 作 出 に成 功 した7)。 こ れ らの 胚 の一 部 は実 際 に 移 植 さ れ,こ れ ま で に6頭 の ク ロ ー ン ウ シが 生 産 さ れ て い る。 核 移 植 の 反 復 が 何 回 2525 44 蛋白質 核酸 酵素 Vol.42 No.15(1997) V. 細胞周期のミスマッチは核 移植胚の染色体異常を起こす 初 期 胚 の 細 胞 を ドナ ー 核 に 用 い る 一 連 の 研 究 に お い て, ドナ ー 核 と レ シ ピエ ン ト卵 の 細 胞 周 期(図7参 せ が,核 照)の 組合 移 植 胚 の 発 生 に決 定 的 な 影 響 を 及 ぼ す こ とが 明 ら か に な っ た 。 レ シ ピ エ ン ト卵 として用 い られ る未受 精卵 は Database Center for Life Science Online Service 第2減 数 分 裂 の 中 期(MII) に あ る 。 一 方,初 期 胚 の細 胞 核 の 多 く はDNA合 成 期(S 期)あ る い は 間 期(G2期)に あ る。 MII期 の 未 受 精 卵 に は,高 い 卵 成 熟 促 進 因 子(maturation/mitosis/meiosis promoting factor;MPF)活 性 が あ る の で,そ G2期 こ にS期 や の 核 が 移 植 さ れ た 場 合, 染 色 体 の 凝 集(premature chromosome condensa- tion;PCC)が 起 こ り,さ らに レ シ ピエ ン ト細 胞 質 の 細 胞 周 図4 核移 植 の 反 復 に よる胚 の ク ロー ニ ング A:1個 の 受精 卵,a:8個 し,8個 の ク ロ ー ン胚(第1世 (A"1∼A"8)。A'2∼A'8も [長 嶋 比 呂志:動 期 の 進 行 に伴 っ て,移 の ドナ ー 核(割 球)を 取 り 出 す,A′:取 代)を つ くる,a':A'か 華 房(1990)を DNA複 の ク ロー ン胚(第2世 代)を つ く る。 改 変] よ うな,DNAの た,そ れ に よ って最大 何 個 の クロ ー ン胚 集 団 を つ く る こ とが で き る の か 興 味 が も た れ る が,角 田 ら に よ る と,3∼5回 以 上 の 反 復 は困 難 な よ う で あ る。 ク ロ ー ン 胚 の な か に は,お そ ら く一 定 の 頻 度 異 常 複 製(2 倍 体 で は な い状 態 の 核 に お い てDNAの まで 可 能 な の か,ま 植核 の 製 が 開 始 され る。 この ら8個 の 核 を 取 り出 し,核 移 植 を 行 な う 同 様 に処 理 し,合 計64(82)個 物 の 人 工 生 殖,裳 り出 した 核 を未 受精 卵 に移 植 た め,複 複 製 が 開始 され る 製 が 重 複 す る と考 え られ る)の 結 果,染 色体 数 の 異 常 が起 こ り,核 移 植 胚 の発 生 能 は損 なわ れ る。 こ れ に対 し,G1あ る い はM期 の 核 を移 植 す る と,こ の よ うな現 象 は起 こ らな い。 これ は,移 植 核 のDNA複 製 で 染 色 体 異 常 を も っ た も の が 現 わ れ る の で あ ろ う。 そ 開 始 時 期 が,レ ま の よ う な胚 を核 の ドナ ー として 核 移 植 を行 な って も,正 く調 整 さ れ る た め と考 え られ て い る。 常 な胚 を 得 る こ と は で き な い の で,核 移植 の反復 に よ 一 方,MPF活 シ ピ エ ン ト卵 の 細 胞 質 と の 間 で,う 性 の 低 下 したS期 の レ シ ピエ ン ト細 胞 っ て ク ロ ー ン胚 の 数 を 無 限 に増 や す こ とは 非 常 に 困 難 質 に ドナ ー 核 が 移 植 さ れ た 場 合 は,核 だ と思 わ れ る 。 期 にか か わ らず,DNA複 こで,レ 2526 の細胞 周 期 の時 製 の 異 常 は起 こ りに くい 。 そ シ ピ エ ン ト卵 に あ ら か じ め 活 性 化 刺 激 を与 え 核移植 による動物クローニングの進歩 VI. 45 胚由来の培 養細胞 を ドナ ー核とする核移植 初 期 胚 細 胞 を核 の ドナ ー と し て核 移 植 を行 な う場 合,生 産 可 能 な ク ロ ー ン胚 の 数 は, 利 用 可 能 な ドナ ー 核 の 数 に よ っ て 限 定 され る。 た とえば,桑 実 期 胚 か ら は16∼32個,胚 盤 胞 の 内 部 細 胞 塊 か ら は20 ∼30個 程 度 の ドナ ー 核 が 得 ら Database Center for Life Science Online Service れ る に す ぎ な い 。 こ の よ うな 制 限 に 対 し,前 述 の 核 移 植 の 反 復 と は 異 な る方 法 で,ク ロ ー ン胚 の 生 産 効 率 を 向 上 させ よ う と い う試 み が あ る 。 そ れ は,利 用 可 能 な ドナ ー 核 を無 制 限 に増 殖 さ せ た の ち,核 移 植 に用 い る とい う方 法 で あ る。 す なわ ち,図5に 示 す よ うに, 胚 細 胞(例:胚 盤 胞 の 内部 細 胞 塊 細 胞)を 培 養 し,十 分 に 増 殖 させ た の ち,そ れ らを ド ナ ー核 に 供 す れ ば,核 移植 を 反 復 す る こ と な く,多 数 の ク ロ ー ン胚 が 生 産 で き る こ と に な る。 ロス リン研 究 所 のCampbell ら の グ ル ー プ は,ク ツ ジ"ド 図5 培養 細胞 の核 移 植 ク ロー ン ヒ ツ ジ"ド リー"は(c)の 材 料 よ りつ く られ た が,そ の 前 段 階 と して(a)由 来の ロー ン ヒ リー"作 出の前 段 階 の 実 験 として,9日 齢 ヒツジ胚 盤胞 の 内部細 胞塊 細胞 に由来 ク ロ ー ン ヒツ ジ作 出 が行 な わ れ た。 す る 培 養 細 胞 株 を樹 立 し,そ て,MIIに 休 止 し て い る細 胞 周 期 をS期 に 進 行 させ た の 細 胞 を 核 の ドナ ー と して 核 移 植 を行 な い,正 段 階 で 核 を移 植 す る とい う方 法 が と られ る よ う に な っ ヒ ツ ジ の 生 産 に 成 功 し た(図5a)。 た 。 こ の よ うな 卵 は,細 胞 周 期 に か か わ らず ドナ ー 核 植 に よ っ て 全 能 性 を 示 す こ と か ら,totipotent を受 け入 れ る こ とか ら,"ユ nuclear 卵"と よ ば れ た8)。 ニ バ ー サ ル ・レ シ ピエ ン ト transferの TNT細 略 でTNTと こ の細 胞 は,核 移 for よ ば れ た9)。 胞 は,上 皮 細 胞 様 形 態 を有 し,サ イ トケ ラチ ン や 核 ラ ミ ンA/Cな どの 分 化 マ ー カ ー を発 現 し て い る こ と を特 徴 と す る。 す な わ ち,同 由来 で,未 常 な仔 じ く内部 細 胞 塊 細 胞 分 化 な 状 態 を維 持 して い るES細 胞 とは明 ら 2527 46 蛋 白質 核酸 酵素 Vol.42 No.15(1997) か に異 な るタ イプ の細 胞 で あ る。 この よ うな分化 した こ とが で きれ ば,ウ 細胞 核 を核移 植 に よ って初期 化 し,個 体 発生 に導 く方 の 道 が 開 か れ る こ とに な る。 シ に お い て も高 度 な遺 伝 子 修 飾 へ 法 を確立 した ことが,の ち に体細 胞核 の核 移 植 の成 功 とい うブ レイ クスル ー を生 みだ す基礎 となった の であ VII. MAGIC法 とGOAT法 る。 さ らに この成果 は,家 畜 の遺 伝 子操 作 へ の応用 とい Campbellら のTNT細 胞 の 核 移 植 の研 究 で は,分 化 う側 面 に お い て も重 大 な 意 味 を もつ(図5)。 現 在,マ ウス 以 外 の 動 物 種 で は,完 全 な ES細 胞(生 殖 細 胞 系 に組 み 込 まれ る能 力 を も つ も の)が 立 さ れ て お らず,そ 樹 のた め ジ Database Center for Life Science Online Service ー ンター ゲ テ ィング に よる遺 伝 子 ノ ッ ク ア ウ トな ど,高 度 な遺伝 子操 作 へ の道が 閉 ざ さ れ て い る。TNT細 胞 は増 殖 能 力 に 優 れ た 細 胞 株 で あ り, これ に 対 す る種 々 の 遺 伝 子 修 飾 を行 な う こ と は 可 能 で あ る と考 え られ て い る。 す なわ ち, ES細 胞 が い まだ樹 立 され て い な い ヒ ツ ジに お いて,TNT細 胞 は そ の代 替 細 胞 と な り う る と い う こ とが で き る。 胚 由来 培 養 細 胞 の 核 移 植 は,ウ シ で も行 な わ れ て い る。 ウ ィ ス コ ンシ ン大 学 のSimsら は,ウ シ胚 盤 胞 の 内 部 細 胞 塊 細 胞 か らES細 胞 を得 て,そ 胞 様 の培 養 細 れ ら を6∼27日 の培養 後 に核移 植 に用 い た結 果,正 常 な 仔 ウ シ を作 出 した と報 じた10)。この細 胞 はTNT 細 胞 の よ う に株 化 され た 細 胞 で は な い の で,Simsら は,比 の業 績 較的 短期 間 に限 定 して 培 養 され たES様 細 胞(お そ ら く比 較 的 未 分 化 で あ る)を ド ナ ー 核 と す る核 移 植 と理 解 す る こ とが で き る 。 こ の ウ シES 様 細 胞 に対 し て,遺 伝子ノッ ク ア ウ トな どの 操 作 を 行 な う 2528 図6 培 養 細 胞 の核 移 植 に よ る ヒツ ジの ク ロー ニ ン グ に用 い られ た3種 の 方 法 乳 腺細胞の核移植 にはGOAT法 が用い られ た。[文献11を 改変] 核移植 による動物 クローニ ングの進歩 した 核 を初 期 化 す るた め の,非 常 に重 要 な方策 が示 さ れ て い る。 核 移 植 に お い て,ド ナ ー核 とレ シピエ ン ト 細 胞 質 と の 間 の,細 胞 周期 の マ ッチ ングが重 要 な こと は す で に述 べ た が,Campbellら は,6∼13回 たTNT細 胞 の 核 移 植 を,図6に 行 な い,核 移 植 胚 の 発 達 を比 較 し た 。 こ の 方 法 の 第 一 の 特 徴 は,核 期 が,G0期 示 す3種 継 代 され 類 の方法 で の ドナ ー 細 胞 の細 胞 周 に 同 期 化 さ れ た こ とで あ る 。G1期 体 核 は,MPF活 の2倍 図7 る 。 培 養 細 胞 を 低 栄 養(低 と,細 胞 周 期 がG1期 血 清 濃 度)培 地 で培 養 す る に 似 たG0期(図7)で この こ と を利 用 し,TNT細 Database Center for Life Science Online Service 細 胞周 期 の構 成 性 の 高 い レ シ ピエ ン ト卵 へ 移 植 され て も,染 色 体 の 異 常 複 製 を起 こ さ な い こ とが 知 られ て い 期 化 し,MII期 47 休 止 す る。 胞 の細 胞 周 期 をG0期 に同 の レ シ ピ エ ン ト卵 へ の 移 植 を行 な っ た の で あ る 。 また,G0期 核 の 染 色 体 は,レ シ ピエ ン ト卵 TNT細 胞 の核移 植 には,3種 の方法 が用 い られた こ とは す で に述 べ た が,体 細 胞 の核 移 植 で は も っ ぱ ら GOAT法 が用い られたので,方 法 の理解 のためには,図 6を 参 照 され た い。 核 の ドナ ーで あ る乳 腺細 胞,胎 仔繊 維芽 細胞 お よび 対 照 としてのTNT細 胞 は,低 栄養 培地(低 血清 濃 度) の 細 胞 質 中 の フ ァ ク タ ー に よ り,初 期 化 の た め の 修 飾 で培 養 され,あ らか じめ細胞 周 期がG0期 を 受 け や す い と も考 え ら れ る。 これ らの細 胞 の核 を移 植 す るレシ ピエ ン ト細 胞質 には, 一 方,ド ナ ー 核 の レ シ ピエ ン ト卵 へ の 移 植 に お い て, (1)卵 の活 性 化 後 に核 移 植 を行 な う方 法,(2)核 の 活 性 化 を 同 時 に 行 な う 方 法(G0/G1 transfer;GOAT法),(3)核 arrested cytoplast;MAGIC法),が す な わ ち,(1)は け 入 れ る,"ユ activation 移 植 を行 なっ たの ち に卵 の 活 性 化 を 行 な う 方 法(metaphase accepting 移 植 と卵 ヒツ ジの卵管 の 中 に移 植(数 日後 に 回収)さ れ た ほか, 一 部 の実 験 で は,体 外 培養 に も供 されて い る。 核移 植 系が,胚 の発 生 環境 として十分 で はないためである。 体 ドナ ー 核 を細 胞 周 期 に か か わ らず 受 内培 養,体 外 培養 い ずれ の場 合 も,核 移植 胚 の うち桑 よ び(3)で は,MPF活 植 され た 核 は,高 いMPF活 性 の高 い レシ 性 を もつMII期 レ シ ピエ ン ト細 胞 質 に長 時 間,曝 果 的 に は,3種 核移 植胚 は,そ の発 達能 の確 認 の た めに,い ったん 胚 を生体 内(卵 管)で 培養 した の は,現 在 の体 外培 養 G0/G1 ピ エ ン ト卵 に 核 が 移 植 され て い る 。 と くに(3)の 方 法 で は,移 MII期 の未受精 卵 が用 い られ て い る。 比 較 され た11)。 ニ バ ー サ ル ・レ シ ピ エ ン ト卵"を 用 い た 方 法 で あ り,(2)お の され る こ とに な る。 結 の 方 法 の す べ て に よ っ て 産 仔 が 得 られ, 実期 か ら胚盤 胞 期 に まで発 生 した ものだけが選 ばれ,最 終 的 に借 り腹 雌 に移植 された 。 核移 植 胚 の発達 率 を表2に ま とめ た。乳 腺細 胞核 を もつ核 移植 胚 は合 計277個 つ く られ,そ の うち29個 (10.5%)が らは,1∼3個 桑 実期 か ら胚 盤胞 期 に発達 してい る。 これ ず つ合 計13頭 の借 り腹 雌 に移植 された。 ま た 核 移 植 胚 の 発 達 率 に は 差 が み ら れ な か っ た が, 最終 的 に は1頭 が妊 娠 し,1頭 Campbellら 誕生 した。 は(3)のMAGIC法 こ そ が,分 化細 胞核 の 初 期 化 に最 も有 効 な 方 法 で あ る と考 え て い た よ う で あ の仔 ヒツジ"ド リー"が 胎 仔繊 維芽 細胞 の核 を もつ核 移植 胚 の場 合 は,172個 の胚 を体 内 お よび体 外培 養 の両 方の 方法 で培 養 した結 る。 果,そ れ ぞれ27.4%お VIII. に同調 された。 体 細胞 の 核 移 植-ク ロー ン ヒツジ"ド リ-"の 誕 生 よび54.2%が 桑 実期 か ら胚盤 胞 期 に発達 して い る。 この実験 で は,両 方 の グル ープか ら産 仔 が得 られ て い るが,体 外培 養 され た胚 か ら生 ま TNT細 胞 の核 移 植 の 研 究 に よっ て,分 化 した 核 で あ っ て も核 移 植 に よ っ て 初 期 化 さ れ,そ の 結 果,そ れた仔 ヒツジ は,生 後 す ぐに死 亡 してい る。 の核 分化 した体細 胞 の核 を初 期 化 す る卵 細胞 質 中の 因子 を 受 け取 っ た 核 移 植 胚 が 正 常 な 個 体 に まで 発 生 し う る は,転 写 調節 因子 ある いは染色 体 結合 蛋 白質 の よ うな こ とが 明 らか とな っ た 。 この成 果 を基 に,Wilmutら 体 細 胞 の核 移 植 は行 な わ れ た4)。 の もので あ ろ うと思 わ れ る。 また,こ の因子 は,胚 ゲノ ムの活 性化 が起 こり,母 性mRNAが 消失 す る時期 まで 2529 48 蛋白質 の 卵(初 核酸 期 胚)細 酵素 Vol.42 胞 質 中 に存 No.15(1997) 表2 培 養 細 胞 の核 を もつ 核 移植 胚 の発 達 能4) 在 す る と推 測 され る。 ヒ ツ ジ の 胚 ゲ ノ ム 活 性 化 は,8∼16 細 胞 期 に起 こ るの で,MII期 の 卵 に 移 植 さ れ た 核 は,理 上,細 胞 周 期(分 論 割)が2 ∼3回 進 行 す る ま で の 間 ,初 期 化因 子 の影響 下 に置 かれ る ことにな る。 胚 ゲ ノ ム の 活 性 化 時 期 は, ウ シで は ヒ ツ ジ と同 じ く8∼16 Database Center for Life Science Online Service 細 胞 期,ブ タ で は4細 胞 期, マ ウスで は2細 胞期 と,動 物種 問 で異 なって い る。分 伝子 ノ ックア ウ トを含 む)の 生 産 と利 用 は,飛 躍的 に 化 した核 の初期 化 に は,初 期化 因 子 の影響 を受 け るチ 進歩 す るで あろ う。 ャンスが多 い ほ ど有 利 であ ろう。 ヒツジや ウシで は,胚 で は,ク ローニ ングの本 来 の意 味 であ る,個 体複 製 由来培 養細 胞 の初期 化 が可 能 で あ るの に対 し,マ ウス 化 の実 用化 あるい は産 業的利 用 の可 能性 は ど うだ ろ う や ブタで は,あ る程 度 発生 段 階 の進 んだ初 期胚 細胞 核 の初期 化 さ え も困難 で ある とい う,動 物種 間 の核 移植 か?畜 産 におい て は,た とえ ば高能 力 の乳牛 の コピ ー を大 量生 産 した り,肉 用 家畜 の種 畜 の均 一 な集 団 を の難易 度 の差 は,こ の胚 ゲ ノム活 性化 時期 の違 い に起 つ くり出 す ことな どで,生 産 性 の向上が期 待で きる。 し 因す る と考 え られ る。 かし,家 畜 の集 団の遺 伝 的な均一 化が過度 に進 めば,そ の弊害 が 現わ れ る危険 性 もあ る。 なぜ な ら,ク ロー ン IX. ク ローン動物の実用化 は近 いか? 家 畜 の集 団 は,何 らかの疾 病 の流 行 や環境 の 変化 な ど に対 す る適応 力 の多様 性 に乏 し く,そ のた め集 団全体 ク ロ ー ン ヒ ツ ジ"ド Therapeutics社 リー"作 が壊滅 的 な被 害 を受 け る可能性 が あ るか らで あ る。 出 の 研 究 に は,PPL も関 与 して い る 。 この 会 社 は,血 友 病 絶滅 の 危機 に瀕 す る野生 動物 の増殖 も,ク ロ ーニ ン 治 療 薬 とな る ヒ ト血 液 凝 固 因 子 な どの有 用 蛋 白 質 を,ト グ技術 利 用 の潜在 的対 象 で あ ろ う。 た とえば,現 存 頭 ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク ヒ ツ ジ を動 物 工 場 と して 生 産 し て い 数 の非 常 に少 な い シベ リア タイ ガー の細胞 核 を,比 較 る。 現 在,ト ラ ンス ジ ェ 的頭数 の多 いイ ン ドシナ地域 の トラの卵 に移植 して,個 入 に よ って 体 の複 製化 を図 る こ とな どは,将 来 の研 究 課題 として の 方法 で は導入 遺伝 子 の発 現 の頻度 興 味深 い。 しか し,そ の た め には当然,ト ラの初期 発 ラ ンス ジ ェ ニ ッ ク家 畜 は,ト ニ ツ ク マ ウス と同 様 に,受 精 卵 へ のDNA注 つ く られ るが,こ が 低 く,か つ そ の 発 現 の制 御 が 困 難 な た め に,希 望 ど お りの トラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク個 体 を 得 る た め に は,数 多 生 に関 す る知見 が,ま ず十分 に蓄積 され る必要 がある。 クロー ンヒツジ"ド リー"を 生 み出 した背景 には,家 の た め多大 な 畜 の胚 移植,胚 の培 養,顕 微 操 作 などに関す る30年 以 経 済 的 ・時 間 的 コス トを 要 す る[ト ラ ンス ジ ェニ ッ ク動 上 の研 究 の歴 史が あ る。 しか し,野 生 動物 を対 象 とす 物作 出の詳 細 につ いて は,本 誌 増 刊 号 『トラ ンスジ ェニ ック る核移 植 の研 究 は,実 験材 料 を十 分 に得 るこ とが で き 動物 』(現在,単 行 本 として 発行)を 参 照 され たい]。 す で に な い とい う大 きな制約 を受 け,そ の進 展 に は非常 な困 述 べ たTNT細 難 が伴 うで あ ろ う。 くの 実 験 を く り返 さ な け れ ば な らず,そ 胞 に対 し て 遺 伝 子 導 入 を 行 な い,遺 伝 子 発 現 が 適 当 な細 胞 を 選 択 し,そ の 核 を 用 い て核 移 植 を行 な え ぼ,ト ラ ンス ジ ェニ ック個体 作 出 の効率 を向 上 さ せ る こ とが で き る。 ヒ ツ ジTNT細 養 細 胞 株 が,ウ シ,ヤ ギ,ブ お い て も開 発 さ れ れ ば,ト 2530 胞 と同 様 の培 タな どほかの 主要 家畜 に ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク家 畜(遺 おわ りに "ド リー"の 作 出 に 用 い られ た 方 法 が,他 動 物 に も応 用 し う る な ら ば,核 の 移 植 に よ る ヒ トの ク ロ ー ニ ン グ は,理 論 的 に は 可 能 で あ ろ う。 不 妊 治 療 と し 49 核移植 による動物クローニングの進歩 て 行 な わ れ る 体 外 受 精 の 研 究 と普 及 に 伴 い,ヒ トの 卵 学 上 の一 大 ブ レイ ク ス ル ー で あ る と同 時 に,哺 乳 動 物, 結 保 存,顕 微 操 作 な どに関 す る知見 と く に家 畜 の 遺 伝 子 操 作 の 新 時 代 を 告 げ る もの と認 識 は,近 年 急 速 に集 積 さ れ,い まや 家 畜 に お け る そ れ に さ れ る べ き で あ る。 の 培 養,移 植,凍 迫 る レベ ル に ま で 到 達 し て い る。 つ ま り,ヒ トの ク ロ ー ニ ン グ に挑 戦 す る た め の 発 生 工 学 の 基 盤 は ,す でに 存 在 してい るの であ る。 し か し,現 文 実 に そ れ を行 な うた め に は,当 然,な 多 くの 試 行 錯 誤 を 経 な け れ ば な らず,そ くの 実 験 材 料,す お な わ ち ヒ トの 卵 と ク ロ ー ン胚 の レ シ 乳 動 物 の ク ロ ー ニ ン グ を手 が け て い る,す (1966) 2) Gurdon,J.B.:J.Cell 3) Illmensee,K.,Hoppe,P.C.:Cell,23,9-18 4) Wilmut,I.,Schnieke,A.E.,McWhir,J.,Kind,A. べ Sci.,Suppl.4,287-318 J.,Campbell,K.H.S.:Nature,385,810-813 (1997) McGrath,J.,Solter,D.:Science,220,1300-1302 6) Willadsen,S.M.:Nature,320,63-65 の ク ロー ンヒ ツ ジの 誕 生 に よっ て, 7) 角 田 幸 雄 近 い将 来 に 世 界 中 で ク ロ ー ン人 間 が 誕 生 しか ね な い よ 8) Campbell,K.H.S.,Loi,P.,Cappai,P.,Wilmut, さ に 稀 少 な野 生 動 物 を 対 象 に研 究 を行 な お う とす る に 等 し い 制 限 要 素 と な る。 した が って,1頭 う な 危 惧 を抱 く こ と は,ま (1983) ・加 藤 容 子:科 (1986) 学,67,344-347 I.:Biol.Reprod.,50,1358-1359 っ た く非 現 実 的 で あ る 。 9) とは い え,も (1997) (1994) Campbell,K.H.S.,McWhir,J.,Ritchie,W.A., しあ る 独 裁 者 に よ っ て研 究 が 国 家 的 に Wilmut,I.:Nature,380,64-66 行 な わ れ る よ う な こ とが あ れ ば,お そ ら く ヒ トの ク ロ 10) ーニ ングはや が て可能 とな ろ う 。 科 学 技 術 は諸 刃 の 剣 で あ る。 細 菌 学 の進 歩 と細 菌 兵 器 の製 造 との 関 係 は,現 代 科 学 の 内 包 す る ジ レ ン マ の 生 物 学 領 域 に お け る典 型 とい え るが,細 (1986) (1981) 5) て の 発 生 工 学 研 究 者 に とっ て,ま Database Center for Life Science Online Service 献 Gurdon,J.B.,Uehlinger,V.:Nature,210,12401241 のた め には多 ピエ ン ト(借 り腹 の 女 性)が 必 要 で あ る 。 こ の こ と は, 現 在,哺 1) 90,6143-6147 11) 菌 学 の 発 展 を抜 き に し て 今 日 の 人 類 の 繁 栄 は 考 え ら れ な い 。 同 様 に,動 物 の ク ロ ー ニ ン グ 技 (1994) Campbell,K.H.S.,Ritchie,W.A.,McWhir,J., Wilmut,I.:ET 12) Newslett.,14,12-17 (1996) Cheong,H.-T.,Takahashi,Y.,Kanagawa,H.: Biol.Repyod.,48,958-963 術 に は,個 体 の複 製 や遺 伝 子 操 作 を通 じて の,生 物 ・医 14) (1996) Heyman,Y.,Renard,J.P.:Anim.Reprod.Sci., 42,427-436 13) (1996) Sims,M.,First,N.L.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA, (1993) Heyman,Y.,Chesne,P.,Renard,J.P.:C.R. 学 研究 や農 業生 産 へ の大 いな る貢献 の 可能性 が 秘 め ら Acad.Sci.Paris,311,321-326 れ て い る。 15) "ド リー"の 誕 生 は,動 物 細 胞 の 分 化 が 遺 伝 子 の不 可 逆 的 な 変 化 に よ る もの で は な い こ と を証 明 した,生 (1990) Prather,R.S.,Sims,M.M.,First,N.L.:Biol. Reprod.,41,414-418 (1989) 物 2531
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