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蛋白質核酸酵素:表面プラズモン共鳴 (SPR) を利用したバイオセンサー

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表 面 プラズモ ン共 鳴 (SPR) を利 用 した
バイオ セ ンサ ー
笠 井献一
表 面 プ ラ ズ モ ン共 鳴 を 利 用 した バ イ オ セ ンサ ー が 最 近 実 用 化 され た 。 これ は 基 礎 的 な生
化 学, 分 子 生 物 学 の 研 究 を大 き く推 進 させ うる, 新 しい 手 段 に な る可 能 性 が 高 い。
は じめ に
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バ イ オ セ ンサ ー は生 体 分 子 の能 力 を利 用 し
場 に 出 た ば か りな の で, もち ろ ん ま だ 揺 篭 期 で は あ る
たテ ク ノ ロジ ー の うち で も, と くに将 来 の発 展 へ の期 待
が, た いへ ん魅 力 的 な能 力 を も っ て お り, こ れ ま で 楽
が 大 き い も の のひ とつ であ ろ う。 しか し, 期 待 感 の 大 き
で はな か った 実 験 が い とも簡 単 に で き る。 分 子 の レベ ル
さ に く らべ る と問 題 が 山 積 み で, 実 用 的 に は ま だ ま だ と
の 生命 科 学 研 究 に と って, 新 しい 強 力 な 武 器 に な る に
い うの が現 実 で あ った 。 感 知 部 分 に酵 素 を 使 うの か, そ
違 いな い の で こ こ に紹 介 した い。 な お, 現 在 の と こ ろ
れ 以外 の結 合 蛋 白質 を 使 うのか, 検 出手 段 は 何 か, ど う
Pharmacia
や って増 幅す る のか, 汎 用 性 を もた せ る に は ど う した ら
ー) しか な い の で, 具 体 的 な点 で あた か も この 装置 の解
よい か, な ど決 め手 が 定 ま っ て い な い の で, 装 置 に つ
Biosensor 社 の製 品 (BIAcore バ イ オ セ ンサ
説 書 の ご と くにな っ て しま う こ とを お 断 りして お く。
い て も試 作機 の段 階 で あ り, バ イ オ セ ンサ ー とは まだ 特
I.
別 な研 究 室 だ け が使 い こ なせ る も の で, ふ つ うの研 究 者
表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 の 原 理^<1∼3)>
が 分光 光 度計 なみ の感 覚 で使 え る とい うに はほ ど遠 か っ
こ の方 法 を か い つ ま ん で い え ば, セ ンサ ー表 面 に接 触
た。
しか し ご く最 近, ふ つ うの研 究 者 で も気 軽 に 使 え る
してい る溶 液 の屈 折 率 が 変 化 す る と, 光 の強 さ の変 化 と
くた だ し気軽 に買 え る値 段 とは い い に くいが) パ イ オ セ
して検 出 で き る とい うこ とにつ き る が, そ の測 定 の原 理
ンサ ー装 置 が彗 星 の ご と く現 わ れ, 新 しい時 代 が 到 来 し
が ま った く 目新 しい。 屈 折 率 の高 い ガ ラス の 中 を進 む光
一
た とい え そ うで あ る
が あ り, そ の入 射 角 が 外 部 との界 面 で全 反 射 す る よ うな
。 これ は表 面 プ ラス モ ン 共 鳴 (sur
faceplasmon
に基 づ い て い る。 ほ と
も のだ った とす る と, 光 は ガ ラ ス の外 に は 出ず に反 射 さ
ん どの 生 化学 者 が初 め て聞 くで あ ろ う原 理 が, い きな り
resonance;
SPR)
れ て しま うだ ろ う。 とこ ろが, そ の反 射 面 に金 属 の薄 膜
実用化 さ れ て しま った の に は面 食 ら うこ と と思 うが, こ
が 接 触 して い る と, 全 反 射 す る よ うに 入射 した 光 の うち
の 原理 に は バ イ オ セ ンサ ー と して利 用 す る には 非 常 に有
で, あ る角 度 で入 射 した も の は 吸収 され て しま うの で,
利 な特 質 が あ る。
そ れ に 対 応 す る反 射 光 の強 度 が 減 少 す る。 そ の よ うな減
バ イ オ セ ンサ ー とい う と, 何 か を特 異 的 に検 出 し, さ
光 が 見 られ る角 度 は, 金 属 薄 膜 の外 側 に接 して い る溶 液
ら に は 定量 す る とい うあた りで, どち らか とい うと実 用
な ど の媒 質 の屈 折 率 に依 存 して い る。 そ こで反 射 光 の 強
向 け の もの を連 想 す る が, SPRは
そ れ 以 上 に, 特異 的 相
度 が低 下 す る よ うな 入射 角 を測 定 す れ ば, 溶液 の屈 折 率
葦 作用 の解 析 とい った 純 粋 な基 礎 研 究 にお お い に 貢 献 し
(生化 学 者 に とっ て は濃 度 と読 み か え て も よ い だ ろ う)
そ うで あ る。SPRバ
が わ か り, そ の変 動 は セ ンサ ー に接 す る溶 液 中 の物 質 量
Ken-ichi
Kasai,
University,
イ オ セ ンサ ー は昨 年 (1991年)
帝 京 大 学 薬 学 部
Sagamiko,
Kanagawa
(〒199-01
199-01,
市
神 奈 川 県 津 久 井 郡 相 模 湖 町
1091-1)
[Faculty
of Pharmaceutical
Sciences,
Teikyo
Japan]Biosensor Based on Surface Plasmon Resonance
Key【バイオセンサー】
word
【
表面 ブラズモ ン共鳴】【特異 的相互作 用】
2977
蛋 白 質
54
図1.
表 面 プ ラズ モ ソ共 鳴 (SPR)
核 酸
酵 素
Vol. 37
No. 15
(1992)
の原 理
金 属 の 薄 膜 を は りつ け た ガ ラ ス の 中を 光 が 進 み, 界 面 で 全
反 射 す る と き, エ バ ネ ッセ ン ト波 の波 数 と表 面 プ ラズ モ ンの
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波 数 が 一 致 す る と (k_e=k_<sp>),入 射 光 の エ ネル ギ ーが 表 面 プ
ラズ モ ンの 励 起 に 使 わ れ (共 鳴 し), 反 射 光 が 減 少 す る 。
の変 動 を反 映 す る こ とに な る。
も う少 し詳 し くい う と, 光 が ガ ラス と外 との 界面 で全
反 射 す る とき, そ の 界 面 に エ バ ネ ッセ ン ト波 と い わ れ
る, 表 面 だ け を伝 わ る波 が ご くわ ず か に じ み だ す 。 一
方, 金 属 の 薄膜 に も表 面 プ ラ ズ モ ン (SPR)
といわ れ る
表 面 波 が 生 じ う る (金 属 は 固 体 プ ラズ マ と見 なす こ とが
図2.
で き, そ の表 面 に 生 ず る電 荷 密 度 の 波 を 量 子論 的 に表 面
プ ラ ズモ ン とい う)。 この2つ の表 面 波 の波 数 が 一 致 す
る と共 鳴が 起 こ り, 光 の エ ネ ルギ ーの 一 部 がSPRを
(a)
BIAcore
装 置 で 使 わ れ るセ ンサ ー の 概 念 図
セ ソサ ー チ ップ の 外 形, (b)
光 学 系 の 関 係,
(c)
セ ンサ ー フ ロ ー セル と
セ ンサ ー 部 の 拡 大 図 。
励
起 す るた め に 使 わ れ, 反 射 光 と して 戻 る分 が減 る の で あ
る (図1)。
SPRの
波 数k_<sp>は次 の 式 で 表 わ され る。
(1)
ωは 角 振 動 数, cは
光 速 度,
εは 金 属 の誘 導 率, nは 金
属 に接 す る媒 質 の屈 折 率 であ る。 一 方, エ バ ネ ッセ ン ト
波 の波 数k_eは,
入 射 光 の波 数 ベ ク トル をk_p, 入 射 角 を
θ とす る と, 以 下 の よ うにな る。
k_e=k_psinθ
も しもk_pとk_eが
SPRの
一 致 す れ ば,
(2)
励 起 に 使 わ れ る こ とに な る の で, そ れ を 満 た す
よ うな 入射 角 θ と媒 質 の屈 折 率nと
図3.
反射光の角度 と相対強度の関係を示す グラフ
光 の エ ネ ル ギ ーが
の 関係 が決 ま るわ け
で あ る。 また, こ こ で強 調 す べ き こ とは, SPRは
実 際 には, セ ンサ ーへ は くさび 型 の 光 を 入 射 さ せ (図2
b),
い ろ い ろ な 方 向 へ の 反 射 光 強 度 を 一挙 に 測定 す る。
金属表
こ うす る とま った く可 動 部 分 のな い 光 学 系 で 時 々 刻 々
面 で の現 象 な の で, 金 属 膜 表 面 の ご く近 くに あ る媒 質 か
(リ ア ル タイ ム) の測 定 が で き, 安 定 性, 耐 久 性 の面 か ら
ら しか影 響 を受 け な しめ 表 面 か ら1μm以
有 利 で あ る。 これ か ら, あ る入 射 角 に 対 して 谷 を も った
上 離 れ た媒 質
は実際 上 ば問 題 にな らな い。 こ う して 金 属 薄 膜 め ご く近
反 射 光 強 度 曲線 が得 られ (図3),
くで濃 度変 化 が あ れ ば, そ れ が屈 折 率 に反 映 し, 反 射 光
ら, セ ンサー に角触れている溶 液の濃 度 が 変 化 した こ とが
強 度 を減 少 させ る 入射 角 θが 変化 す る。
わ か る。
2978
k_<ps>=ω/c√<εn^2/ε+n^2>
も しこの 谷 が ず れ た な
表 面 プ ラズ モ ン共 鳴
(SPR)
55
を 利 用 した バ イ オセ ンサ ー
違 った 性 能 が な け れ ば 存 在 価 値 は 薄 い 。 また 誰 で も使 え
II
.
SPRを
利 用 す る こ と の利 点
る よ うに, 使 用 者 自身 で 目的 にか な った セ ンサ ーを 気 軽
に つ くれ る こ とが 重 要 で あろ う。 そ れ を 可 能 にす るた め
この方 法 に は, 従 来 の測 定 法 の常 識 か らは 想 像 もつ か
チ ップ とい う形 に してお き, そ れ を 装 置 に は め込 む と フ
な い よ うな大 きな 利 点 が い くつ もあ る。
(1)
セ ンサ ー表 面 で起 こ る媒 質 の 屈折 率 の 変化 が,
そ の 場 で (リ ア ル タ イ ム に) 検 出 で き る の で, 実 験 の進
行 状 況 が 常 に 目に見 え, 速 度 論 的 実 験 も で き る。
(2)
光 は試 料 溶 液 の 中を 通 ら ない 。 した が っ て試 料
ロー セ ルが 形 成 され る よ うに な っ てい る。
セ ンサ ーチ ップは ち ょ うど チ ュ ーイ ン ガ ム の よ うな大
き さ の (22×86×0.8mm)
い た9mm四
プ ラス チ ッ ク板 で, 中央 に空
方 の窓 に, 金 の 薄 膜 (厚 さ50nm)
をは り
液 の着 色, 不 透 明 さ, 不 溶 物 や 気 泡 の存 在 な どか ら影 響
つ けた ガ ラス が は ま っ て い る (図2a)。
を 受 け に くい 。
こ の チ ップ を光
学 部 分 に はめ 込 む と, ガ ラス窓 の 内側 (金薄 膜 側) が セ
目的物 の光 学 特 性 とは無 関 係 に光 の 吸収 が 起 こ
ンサ ー セ ル表 面 に な る。 そ こ に細 か い溝 を 切 っ た ブ ロ ッ
る ので, 目的 物 の 吸 収 ス ペ ク トル な どを考 慮 す る必 要 が
ク (カ ー トリ ッジ) が お しつ け られ て, 横 並 び の4つ の
ない。
フ ロー セ ル に区 切 られ る。 そ れ ぞ れ を 独 立 した セ ンサ ー
(3)
屈 折 率 の変 化 (主 と して密 度 の変 化 を 反 映 す
と して使 うの で, ひ とつ の チ ップ で4種 類 の実 験 が で き
る) を 検 出す るの で, 対 象物 に レポ ー タ ー基 や放 射 性 標
る。 こ う して形 成 され た セ ンサ ー フ ロー セ ル は, ひ とつ
識 な どを つ け る必要 が な い。
ず つ が, 長 さ, 幅, 厚 み が そ れ ぞ れ2.1,
(4)
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に, セ ンサ ーを 装 置 に組 み 込 まず, 使 い捨 て の セ ンサ ー
(5)
セ ンサ ー表 面 か ら1μm以
内 とい う ご く狭 い範
mmで,
光 が あ た る部分 の表 面 積 は1mm^2を
0.55,
0.05
わず かに
囲 内 の媒 質 の性 質 だ け が 寄与 す る の で, 試 料 溶液 の必 要
上 回 る にす ぎ な い。 こ こに溶 液 を送 る きわ め て 微 細 な 流
量 は きわ め て少 な い 。 セ ル の 容量 もきわ め て 小 さ くてす
路 が カ ー トリ ッジ の 中 に つ く られ て お り, 微 小 な バ ル ブ
む。
で どの フ ロー セ ル に溶 液 を送 るか を制 御 して い る。
同 じ理 由 か ら, セ ンサ ー に充 分 近 づ い た (セ ン
ヤ ンサ ー チ ップ は ケー ス に 入 って お り, そ れ ご と光 学
サ ー表 面 に濃 縮 され た) 成 分 につ い て の情 報 だ け を抽 出
(6)
部 分 に差 し込 ん で使 うの で, ち ょ う ど コ ン ピ ュ ー タ に フ
で き, バ ック グ ラ ウ ン ドノイ ズ が少 な い。
ロ ッ ピー デ ィス クを差 し込 む よ うな感 覚 で あ る 。
(7)
本 質 的 に 面 が 関与 した現 象 な の で, 特 異的 リガ
発 光 ダイ オ ー ドか ら くさ び型 の 近赤 外 のp偏 光 を 窓 に
ン ドを 固 定 す るの に そ の 面 を利 用 で き る。 ま た, 分 子 が
入射 し, 反射 光 を測 定 し図3の
相 互 作 用 の場 まで 速 や か に到 達 で き る。 固定 化 そ の もの
に対 応 す る 入 射角 を 求 め る。 実 際 に 必 要 な の は, 反 応 な
の 成 否, 固 定 化 され た量 な どの情 報 もた だ ち に 得 ら れ
どに伴 う角 度 の変 化 量 で あ り, これ を 共 鳴 シ グ ナ ル とよ
び, 10^<-4>°
の変 化 を1RU
る。
度 変 化0.1°,
III.
SPRバ
イ オ セ ンサ ー 装 置
よ うな グ ラ フを 描 き, 谷
(resonance
unlt) とす る。角
つ ま り10^3RUを1kRUと
蛋 白質 の 場 合, セ ンサ ー表 面1mm^2あ
よぶ 。 多 くの
た り1ng結
合す
る と, この く らい の シ グナ ル 変化 が 生 ず る (糖 蛋 白質 の
こ の原 理 を ガ スの 検 出, 屈 折 率 の測 定 な どへ利 用 す る
場 合 は や や低 くな る)。BIAcoreバ
提 案 も初 期 には な され た が^<4)>,
や が て バ イ オ セ ンサ ー ヘ
上 限 が ほ ぼ60kRU,
の 利 用 が 試 み られ た^<5,6)>。
そ して, 1991年
を 測 定 で き, また 信 頼 で き るRU値
に実 用 的 製 品
イ オ セ ンサ ー で は,
つ ま り6° く らい ま で の 角 度 変 化
の変 化 量 の下 限 は
が 発 売 され た 。1984年 ごろか ら開 発 に着 手 した と の こ と
50以 上 とさ れ て い る。 した が って, 蛋 白 質 な らば セ ン
な の で, 実 体 化 まで わず か に数 年 しか か か って い な い が,
サ ー表 面1mm^2あ
上 で述 べ た 原 理 的 な 利 点 を充 分 に 生 か す べ く, 操 作 の簡
的変 化 が 測定 で きる こ とに な る。
便 化, 微 量 化, 自動 化 が 徹 底 的 に 追 及 さ れ て い る。 よ く
た り50pg
か ら60ngの
蛋 白質 溶液 自体 は, 濃 度 が100μg/mlで
範 囲 の量
も, RUを
練 られ た 装 置 で, わ れ わ れ が モ ル モ ッ トに され る心 配 は
20く ら い しか上 昇 さ せ な い。 した が っ て, セ ンサ ー表 面
な さそ うで あ る。
に濃 縮 され な い か ぎ り, 測 定 値 に 意 味 あ る影 響 を与 え な
い 。 これ も特 異 的 検 出 に と っ て有 利 な と ころ で あ る。
1.
実 際 のセ ンサ ー セ ル
バ イ オ セ ンサ ー と い う か ら に は,
これ ま で とは ひ と味
2979
56
蛋 白 質
2.
核 酸
酵 素
特 異 的 リガ ン ドの 固 定 化
Vol. 37
No. 15
(1992)
系 全 体 の送 液 に は, 注 射 器 型 の簡 単 な ポ ンプを 使 って
セ ンサ ー表 面 に な ん の処 理 を しな くて も, 溶 液 の 屈折
い る。 コ ン ピ ュー タ の指 令 で移 動 す る 中 空 針 (ニ ー ド
率 や 塩 濃 度 を 測 定 す る の に使 え るが, バ イ オ セ ンサ ーに
ル) が, 指 定 され た場 所 の試 験 管 か ら指 定 され た 量 の溶
す るた め には 金 薄 膜 の表 面 に リガ ン ドを 固 定 化 しな け れ
液 を 吸 い 込 ん で, 流 路 の途 中 に あ る試 料 注 入 口に打 ち込
ば な らな い。金 に直 接 固 定 化 す る のは む ず か しい の で, 足
む 。 こ の ニ ー ドル は 溶 液 を あ る試 験 管 か ら他 の試 験 管 に
場 とす るた め の カ ル ボ キ シ メチ ル デ キ ス トラ ン (CMデ
移 した り, 吸 い 込 み と吐 き出 しを く り返 して溶 液 を混 合
キ ス トラ ン) が 金 薄膜 に結 合 させ て あ る (図2c)^<7,8)>。
こ
させ た りで き る。 した が って, 必要 な試 料 や試 薬 の溶 液
の層 の厚 み は100nmほ
を つ くっ て, 実 験 手 順 を コ ン ピ ュ ー タに 入 れ て し ま え
どで, 蛋 白質 な どの拡 散 を 妨 害
しな い よ うに, 架 橋 は 入 れ て い な い。 ま た, 固定 化 され
ば, あ とは ま った く装 置 に ま か せ き りで す む 。
た 分 子 もか な り自由 に運 動 で き る で あ ろ う。 そ の カ ル ボ
こ の よ うに, 基 礎 研 究 のた め の 道 具 と して み れ ば, 研
キ シル 基 を, 水 溶 性 カル ボ ジイ ミ ド (1-エ チ ル-3, 4-ジ
究 者 が こ こま で な まけ て よい も のだ ろ うか とい う気 もす
メ チ ル ア ミノ プ ロ ピル カル ボ ジイ ミ ド; EDC)
る が, 臨床 検 査 や ス ク リー ニ ン グな ど, ル ー チ ンな 仕 事
N-ヒ ドロキ シス ク シ ンイ ミ ド (NHS)
を使 って
の エ ス テ ル と し,
に使 う こ とを強 く意 識 して設 計 して あ る のだ ろ う。
こ う して 活 性 化 され た カル ボキ シル基 に ア ミノ基 を もつ
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リガ ン ドを 反 応 させ る方 法 が, 標 準 的 固 定 化 法 と して推
3.
ソ フ トウ ェア
最 近 の 研 究機 器 に はや た ら と コ ン ピ ュー タ がつ い て い
奨 され てい る。
固定 化 操 作 は, 装 置 に セ ンサ ー チ ップを と りつ け て,.
必要 な試 薬 溶 液 を プ ロ グ ラム に従 っ て流 す だ け で, 誰 で
るが, そ の ソ フ トウ ェア た る や, 大 半 は ユ ー ザ ー無 視,
使 い 勝 手 悪 く, 不 親 切 き わ ま りな い。 しか し この 装置 の
も簡 単 に行 な え る。 た だ し この や り方 で は, ア ミノ基 の
ソフ トウ ェアは, わ か りや す く親 切, 寛 容 で 使 い や す
な い 物 質 は 固定 化 で きな い 。 しか しア フ ィニ テ ィ ク ロマ
い。MS-Windows
トグ ラ フ ィ ー用 の 吸 着 体 を つ く るの と同 じ よ うに, い ろ
の うえ で 動 き, 装 置 が 働 い て い る最
中 に, 別 の フ ァイ ルを 開 い て以 前 の結 果 の検 討 を す る こ
い ろな 固 定 化 の手 段 が 原 理 的 に は あ りう るか ら, 意 欲 と
とな ど もで き る。 実 験 手 順 を プ ロ グラ ム化 す る には, こ
好 奇 心 さえ あ れ ば い くら で も挑 戦 で き るだ ろ う。
の 装 置 に 特 有 な コマ ン ドを い くつ か憶 えれ ば よ い。 試 料
固定 化 の進 行 状 況 お よび 結 果 が い な が らに して わ か る
こ とが, SPRパ
RU値
イ オ セ ンサ ー の大 きな 強 み とい え よ う。
の時 々刻 々 の変 化 を 見 てい れ ば, 反 応 試 薬 が プ ロ
グ ラム どお りに流 れ て い るか, 終 わ った とき に蛋 白質 が
を 採 取 す る場所, 流 量, 移 す 先, 流 速, あ る操 作 を何 回
く り返 す か, 何 分 ご とに デ ー タを記 録す るか, な どで あ
る。 実 験 の進 行 状 況 の監 視, 終 了後 の デ ー タ処 理 も もち
ろ ん で き る。
確 か に 固 定化 さ れ た か な どが わ か り, 精 神 衛 生 にた いへ
ん よい。
2.
装置の構成
これ ま で とま る で違 う実 験 が で き る装 置 と しては, 意
IV.
1.
実 際
の 使
い 方
リガ ン ドの 固定 化
CMデ
キ ス トラ ンを活 性 化 して, リガ ン ドを 固 定 化 す
外 な ほ ど単 純 な 構 成 で あり, 操 作 も いた って 簡 単 で あ
るに は, セ ンサ ー に 以下 の順 番 で 試 薬 溶 液 を 流 す 。(1)
る。 装 置 全 体 の組 み立 て は, 基 本 的 には 液 体 ク ロマ トグ
EDCとNHSの
ラ フ ィー, あ る い は フ ロー イ ンジ ェ クシ ョ ン装 置 と変 わ
タ ノー ル ア ミ ン溶 液 (残存 活 性基 を つ ぶ す た め), (4)
らな い 。 た だ し, きわ め て 微量 の溶 液 を扱 うよ うに細 か
HCl
い 工 夫 が な され てい る (5μl/分 く らい の流 速 で使 うのが
は, と くに指 定 しな くて も洗 浄 操 作 が 入 っ て, 前 後 の溶
ふ つ う)。セ ンサ ー チ ップを は め 込 ん だ光 学部 分 が 検 出
液 が 混 じらな い よ うに して い る。 各 試 薬 の濃 度, 反 応 時
器 に相 当 し, セ ンサ ー フ ロー セ ル には 常 に 溶 液 が 送 られ
間 な ど, メー カー が確 か めた 推 奨 条 件 が示 され て い る。
て い る。 そ の他 の部 分 は, ポ ンプ と, ラ ックに 並 べ た試
この操 作 に伴 って, セ ンサ ー セ ル を流 れ る溶 液 の屈 折
混 合 溶 液, (2) 目的 リガ ン ド溶 液, (3) エ
(セ ル表 面 を よ く洗 うた め)。 この 各 段 の あ い だ に
料 溶 液 を取 り扱 う ロボ ッ ト, 操 作 や 計 算 のた め の コ ン ピ
率 に応 じて シ グナ ル が変 わ って い く様 子 が刻 々にわ か る
ュー タ です べ て で あ る。 セ ンサ ー チ ップを 光 学 部 分 に は
(図4)。 最 初 の緩 衝 液 に よ るベ ー ス ライ ンか ら, EDCと
め 込 ん で しま え ば, あ とは コ ン ピ ュー タ が プ ロ グラ ム に
NHSの
従 ってす べ て の操 作 を行 な う。
す る が, 注 入 が終 わ る と再 び 緩 衝 液 に 切 り替 わ るの で,
2980
混 合 溶 液 の注 入 に 伴 い シ グナ 々 は た だ ち に 増 加
Database Center for Life Science Online Service
表 面 プ ラ ズモ ン共 鳴 (SPR)
(1)
NHSとEDCの
57
を 利 用 した バ イ オ セ ンサ ー
図4.
セ ンサ ー フ ロー セ ルへ の リガ ン ドの 固 定 化 と共 鳴 シ グ ナ ル の 変 化
混 合 物 の注 入, (2) リ ガ ソ ド溶 液 (蛋 白 質 な ど) の 注 入, (3) エ タ ノ ー ル ア ミ ンの注 入, (4) 塩 酸 溶 液 の
注 入 (屈 折 率 が 低 い の で, ベ ー ス ライ ン よ り も シ グナ ル が 下 が る), (5) 最 初 と同 じ 緩 衝 液 を 流 す 。
シ グナ ル は低 くな る。NHSが
れ ば, CMデ
カ ル ボ キ シ ル基 に結 合 す
キ ス トラ ンの重 量 は増 加 す る が, 分 子 量 が
小 さい の で, シ グ ナ ルベ の影 響 は わ ず か しか な い 。 リガ
は な い。 セ ンサ ー表 面 に濃 縮 され るた め に は, 等 電 点 よ
りも低 いpHの
緩 衝 液 を 使 わ ね ば な ら な い。 と こ ろが,
活 性 化 カル ボ キ シル基 と反 応 で き るの は, プ ロ トンを 失
ン ド蛋 白質 の 溶液 を 注 入す る と, 固定 化 反 応 が進 む につ
った ア ミノ基 のみ な の で, pHが
れ シ グナ ル は 上 昇 す る が, や が て プ ラ トーに達 し, 反 応
こ の よ うに相 反 す る条 件 の か ね あ い が むず か しい と ころ
低 す ぎて は い け な い 。.
す べ き も のは す べ て 反応 した と教 え て くれ る。 ふ た た び
で あ る。 ふ つ うは蛋 白質 の等 電 点 よ り1∼2低
緩 衝 液 が 流 れ る と, CMデ
反 応 させ る。 強 酸 性 蛋 白質 は, この方 法 で は 固 定 化 で き
キ ス トラ ンに共 有 結 合 しな か
った 蛋 白質 は 洗 い 流 され るの で, シ グナ ル は ふ た た び減
な い と思 った ほ うが よい 。
リガ ン ド固定 化 に 関 して, 現在 の と ころ この よ うな 弱
少 す る。
こ う して (4)
の直 前 まで の操 作 が終 わ った と こ ろ で,
RU値
いpHで
がベ ー ス ライ ン よ り高 くな って い れ ば 固 定 化 は成
点 が あ る が, CMデ
キ ス トラ ン以 外 の もの を 足 場 と し,
違 う反 応 原理 を使 った 固 定 化 法 も今 後 は 出 て く る で あ ろ
功 で あ り, しか もそ の 増 加 量 か ら, 固 定 化 され た リガ ン
ドの量 ま で, た だ ち に わ か って しま う。 各 段 の 所 要 時 間
はふ つ うは数 分 な の で, 全 体 で も1時 間 もか か らな い 。
CMデ
キ ス トラ ンを 固定 化 の足 場 に す る こ とに は, 利
点 と弱 点 が あ る。 推 奨 され て い る活 性 化 条 件 は, カ ルボ
キ シ ル基 のす べ てがNHSエ
ス テ ルに は な らず, あ る程
度, 陰 イオ ンが 残 る よ うに設 定 され て い る。 そ のた め リ
う。 蛋 白質 を 固 定化 す る と き には, ふ つ うは 活 性 化 反 応 の
の ち, 濃 度 が10∼200μg/ml程
度 の 溶 液 を, フ ロー セ
ル 内 に 流 速5μl/分 く らい で, 全 部 で 数 十 μl流す 。 した
が って1∼20μgの
蛋 白質 が あれ ば よい。 この よ うな条
件 で, 多 くの 蛋 白質 は セ ンサ ー表 面1mm^2あ
20ngく
た り5∼
らい 固 定 化 され る。
ガ ン ドが陽 イ オ ン性 分 子 な ら, セ ンサ ー表 面 に 濃 縮 され
て反 応 の機 会 が 高 くな り, した が って 塩 基 性 蛋 白質 な ら
2.
ば, た とえ低 濃 度 であ っ て も濃 縮 効果のため に 固 定 化し
セ ンサー は 何 度 も く り返 え て使 え る必 要 が あ る。 固定
や す い とい う利 点 が 生 まれ る。
しか し, 塩 基 性 で な い蛋 白質 に とらて は あ ま り有 利 で
安 定 性, 再 現 性 な ど
化 リガ ン ドと結 合 した 自的 物 を洗 い流 して, セ ンサ ー表
面 を 再 生 で きな け れ ば な らな い。CMデ
キス トラ ンを結
2981
58
蛋 白 質
核 酸
酵 素
合 した セ ンサ ー チ ップは, 中 性 の緩 衝 液 な らた い て い の
もの に 耐 え る。100mMの
0.5%のSDS,
8M尿
塩 酸 お よび 水酸 化 ナ ト リウム,
素 な どで も3分 以 内 な ら使 用 して
も よい。 セ ンサ ーの再 生 に は, ふ つ う100mM塩
1)
酸 (pH
を3分 以 内 流 して か ら, 再 び 最初 の緩 衝 液 を 流 し,
Vol. 37
No. 15
(1992)
試 料 の 必要 量 に つ い て は, 調 べ た い のが 蛋 白質 だ とす
れ ば, 1∼100μg/mlく
ら い の濃 度 の も のを100μlく
ら
い 用 意 す れ ば よい の で, 結 合 力 の大 き い も の な ら1μg
もあ れ ば 充 分 とい うこ とに な る。 実 際 に固 定 化 リガ ン ド
と相 互 作用 して結 合す る の は数ng以
下 で あ ろ う。
次 の試 料 を注 入 す る。 抗 原-抗 体 の よ うに強 く結 合 し て
い る 場合 で も, この 条 件 で 充 分 に 解離 す る よ うで あ る。
V.
い くつ か の 利 用 法
い うま で もな く固 定 化 リガ ン ドは この 条件 に 耐 え られ な
け れ ば な らな い 。 過 ヨ ウ素 酸 な どの酸 化 力 の 強 い 物 質
1.
は, デ キ ス トラ ンを 酸 化 分 解 す るの で 使 って は い け な
バ イ オ セ ンサ ー の使 い方 と して まず 思 いつ くも のは 特
い。
異 的定 量 法 で あ る。 抗 体 な どの リガ ン ドを 固 定 化 して セ
セ ンサ ー チ ップは 封 入 してあ る袋 か ら出 して, 装置 に
は め 込 ん で72時
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特 異的 定量
間 以 内, く り返 し使 用 は50∼100回
ンサ ーを つ くれ ば, あ とは試 料 溶 液 を ラ ック に並 べ, 試
く
料 の 注 入 ∼ セ ンサ ー の洗 浄 ∼ 再 緩 衝 化 を 次 々 に く り返 す
らい な ら有 効 と メ ー カ ーは 言 っ てい る。 これ は メ ー カー
プ ロ グ ラム を つ くれ ば よい。 た だ し, 目的 分 子 が 低 分 子
と して 保 証 で き る範 囲 とい うこ と で, これ を 過 ぎた らた
(分 子量1,000以
ち ま ち 劣 化 す る とい うわ け では な い 。
あ る。
下) だ と シ グナ ル が小 さ い の が 弱 点 で
そ の よ うな 場合 に は, 別 の抗 体 を さ ら に反 応 させ て シ
3.
実際の測定
グナ ル を 増 幅 す るか, イ ム ノア ッセ イ の よ うに競 合 反 応
特 異的 な セ ンサ ー セル が で きた な ら, 相 互 作用 を調 べ
を 使 って 間 接 的 に 測 るの が よい だ ろ う。 つ ま り 目的 物 の
た い 物質 の 溶 液 を, や は りプ ログ ラ ムに 指 令 させ て 注 入
ほ うを セ ンサ ー表 面 に 固 定 化 し, 既 知 量 の抗 体 と未 知 量
し, RU値
の 目的 物 を 混 ぜ た もの を 注 入 して, 抗 体 の結 合 が妨 害 さ
の変 化 を追 跡 す る。 と くに 結 合速 度 が遅 くな
け れ ば, 5分 く らい 流 せ ば 定 常状 態 に な り結 果 がわ か る
れ た 程 度 か ら, 目的物 の量 を 割 り出す 。
の で, セ ルを 洗 い, 次 の試 料 を注 入 す る。 した が って,
ひ とつ の解 析 に 要 す る時 間 は10分
も あれ ば よ い。 仕 事
を 開始 して か ら, セ ンサ ーが で き るま で にせ いぜ い1時
2.
相 互 作 用 の 強 さ (結 合 力) の 測 定
た とえ ば, 抗 原 を 固定 化 した セ ンサ ー セ ル に抗 体 を 流
間, そ の後 す ぐに 実 際 の 試 料 を 使 って 測 定 で き るか ら,
して, どれ だ けRU値
ま さ し く分 光 光 度 計 な み の感 覚 の実験 とい え よ う。
つ い て の 情報 が得 られ る。 これだ け な ら, 平 衡 状 態 か ら
図5.
(a)
抗 原 固定 化 セ ンサ ー に抗 体 溶 液 を流 し, 反 応 速 度 定 数, 解 離 定 数 を 求 め る
共 鳴 シ グ ナ ル の時 間 変 化,
定 数, R: 共 鳴 シ グ ナ ル 測 定値
に 対 応)。
2982
が 変化 す るか を みれ ば, 結 合 力 に
(b)
(RU単
速 度 定 数 (k+1, k-1) を 求 め る プ ロ ッ ト。A:
位),
[A]:
抗 体 濃 度,
抗 体,
B:
固定 化 抗 原, K_d:
解離
R_<max>:抗 体 大 過 剰 時 の 共 鳴 シ グナ ル (固 定 化 抗 原 の 全 量
表 面 プ ラズ モ ン共鳴
(SPR)
を 利 用 した バ イ オ セ ンサ ー
59
平 衡 定 数 を 求 め るの で, 他 の 多 くの相 互 作 用 測 定 法 と本
質 的 に は 違 わ な い が, SPRセ
ンサ ー では 速 度 論 に 基 づ
く平衡 定数 も簡 単 に求 め られ る とこ ろ に大 きな 特 徴 が あ
る。
抗 原 を 固 定 化 した セ ンサ ーセ ル に 特 異抗 体 を 流す と,
図5aに
示 す よ うに, RU値
が 上 昇 して い く。 この カ ー
ブ には 遊 離 抗 体 が 抗 原 に 結 合 す る過 程 と, 結 合 した 抗体
が 再 び 解 離 す る過 程 の双 方 が 反 映 され て い る の で, 以下
の よ うな 簡 単 な 式 で 解 析 す れ ば よい。
d[AB]/dt=k+1[A][B]-k_<-1>[AB]
=k_<+1>[A]{[B]_t-[AB]}-k_<-1>[AB]
図6.
=k_<+1>[A][B]_t-{k_<+1>[A]+k _<-1>}[AB]
Aは 試 料 液 中 の遊 離 抗 体, Bは セ ンサ ー上 に あ りAが ま
だ 結 合 して い ない 固 定 化 抗 原, ABはAとBの
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[]は
結 合 物,
そ れ ぞ れ の濃 度 を 表 わ す。[B]_tは 固 定 化 抗 原 の
全 濃 度 を 表 わ す 。k_<+1>とk_<-1>は
結 合 と解 離 の 速 度 定 数 で
あ る。 こ の式 を実 際 の測 定 値 に書 き換 え る と,
とな る。RはRU値,
フ を描 く と直 線 とな り (図5b),
ゆ っ く りで も, なか な か離 れ な い も の (MAb25)
もあ
る。 解 離 定 数 が 同 じで も速 度 定 数 は違 う よ うな抗 体 も,
こ の方 法 な ら簡 単 に 見 つ か る だ ろ う。 解 離 速 度 の大 き い
有 効 に利 用 で き よ う。 こ の よ うに, これ ま で は特 別 な技
横 軸 にRを と っ て グ ラ
術 を も った 研 究 室 でな けれ ば 見 られ な か った よ うな現 象
縦 軸 との切 片 をI,
を, い ともや す や す と目 に で き る こ と が, SPRパ
傾
斜 をSと す れ ば,
イオ
セ ンサ ー の最 大 の 長 所 で は な いか とい うの が筆 者 の感 想
k_<+1>=I/[A]R_<max>
k_<-1>
(Pharmacia
小 さ い も のは イ ム ノ ア ッセ イ に使 うな ど とい った判 断 に
R_<max>はセ ンサ ーが 飽 和 した と き
で あ る。縦 軸 にdR/dt,
抗 原 はHIV-1ウ
イル ス の コア 蛋 白 質p24
Biosensor 社 提 供)。
もの は ア フ ィ ニ テ ィ ク ロマ トグ ラ フ ィー の リガ ン ドに,
dR/dt=k_<+1>[A]R_<max>-(k_<+1>[A]+k_<-1>)R
のRU値
固 定 化抗 原 セ ンサ ーに 対 す る, い くつ か の モ ノ ク
ロー ン抗 体 の 結 合 と 解 離 の 測 定 例
であ る。
=S-k_<+1>[A]
とな る。 移 動 相 中 の抗 体 は常 に補 給 され て い る の で,
3.
[A]は
蛋 白質 を 抗 原 とす る モ ノ ク ロー ン抗 体 群 が あ る とき,
一 定 とみ な して よ い (解離 に よ って 増 加 す る 分
モ ノク ロー ン抗 体 の エ ピ トー プ 解析^<10,11)>
は, ふ つ うは無 視 して よ いだ ろ う)。運 度 定 数 が 求 め ら
どれ が 共 通 の抗 原 決 定 基 に対 す る ものか を調 べ る に は,
れ れ ば, 解 離 定 数K_dは
理 屈 の うえ では そ れ ぞ れ の抗 体 ど う しで競 合 さ せ れ ば よ
以下 の よ うに な る。
K_d=k_<-1>/k_<+1>
抗 体 溶 液 を流 し終 わ っ て, 再 び 緩 衝 液 を 流 し始 め る と
RU値
い が, 実 際 に そ の よ うな 実 験 を や る とな った ら, 膨大 な
労 力 と時 間 を 投 入 しな けれ ば な るま い。SPRバ
イ オ セ
は 減 少 して い く。 こ の過 程 は 一 次 反 応 に 従 った 解
ンサ ーは これ を い た っ てや さ しい仕 事 に変 え て し ま っ
離 反 応 で あ るか ら, k_<-1>は
簡 単 に 求 め られ る。 あ るい は
た 。 抗 原 を 固 定 化 した セ ンサ ー セ ル に, まず ひ とつ の モ
半 減 期 τか ら求 め て よ い。 ス トップ トフ ロ ーほ ど の高 速
ノ ク ロー ン抗 体 を 結 合 させ て お く。 そ こに 別 の モ ノ ク ロ
原 応 は無 理 だ が, 分 の オ ー ダ ーの 反 応 な ら充分 に 解 析 で
ー ン抗 体 を 添 加 してRU値
の上 昇 が 見 られ た な らば
,
き る。 メー カ ー では, 速 度 定 数 と して10^3∼10^6M^<-1>s^<-1>そ れ らは 競 合 して いな い の で, 異 な るエ ピ トー プに対 す
を, また 解 離 定 数 と して10^<-5>∼10^<-10>Mを
測定 で き る と
る も のだ とわ か る。 こ う した 実 験 を組 合 せ を変 え て行 な
して い る。 この 系 では 片方 が 固 定化 され て い る の で, 双
え ば よ い。BIAcore装
方 が 溶 液 中 に あ る場 合 と完全 に 同 じ数 値 が 得 られ る とは
い た っ て得 意 な の で, た とえ ば 一 昼 夜 で100通
限 らな い が, 基 本 的 に は ほ ぼ 同等 の情 報 が得 られ る で あ
の組 合 せ の結 果 を 得 る こ とは な ん で も な い。
置 は, こ の よ うな く り返 し作 業 は
り くらい
ろ う。
図6に
い くつ か の モ ノ ク ロ ー ン抗体 の結 合 と解 離 を観
測 して い る例 を 示 した が, 抗 体 に よ ってず いぶ ん性 質 が
4.
そ の 他, 考 え られ る利 用 法
この 方 法 は, 基 礎 科 学 にお い て は, 特 異 的 相 互 作 用 あ
違 う とい うこ とが 実 感 で き る^<9)>。
速 く結 合 す る がす ぐに
る と ころ, あ らゆ る場 面 で解 析 のた め の強 力 な手 段 に な
離 れ て しま うもの (MAb28)
る は ず で あ る。DNAと
も あれ ば, 結 合 す る の は
蛋 白質 との相 互 作 用 解 析 へ の応
2983
60
蛋 白質
核 酸
酵 素
Vol. 37
No. 15
(1992)
用 の報 告^<12)>や,
ウイ ル ス蛋 白質 の空 間 配 置 の研 究 に応 用
とは い うま で もな い が, 大 きな シ グナ ルを 与 え るの で,
した 例 の報 告 が あ る^<13)>。
高 分 子 の ほ うが 検 出 に有 利 な こ
よい実 験 例 を 集 め や す い のか も しれ な い 。 しか し, 低 分
とか ら, リボ ソ ー ムや ヌ ク レオ ソ ー ムな ど, 複 雑 か つ 巨
子 蛋 白質 に は使 え な い とい うこ とは な い。 筆 者 らは 糖蛋
大 な構 造 体 の解 析 な どに は有 利 な の で は な いだ ろ うか 。
白質 を 固 定 化 して セ ンサ ーを つ く り, 分 子 量14,000程
ま た, 現 在 の装 置 では そ の よ うに 意 図 して つ く られ て
度 の低 分 子 蛋 白質 で あ る レ クチ ンの相 互 作 用 解 析 を試 み
は い な い が, た とえば 液 体 ク ロマ トグ ラ フ ィ ー の モ ニ タ
た が, 充 分 に 納 得 のい くデ ー タが 得 られ た 。 感 度 の 面 か
ーに 使 え る よ うに設 計 す れ ば
, 分 析 関 係 で大 き く貢 献 す
らは 不 利 であ るが, 分 子 量 が10,000以
上 で あ れ ば大 丈
るで あ ろ う。 ク ロマ トグラ フ ィ ー の もつ 高 い 分 離 能 力 に,
夫 の よ うであ る。 もち ろ ん 感 度 を 含 め た 性 能 の 向上 は 今
特 異 的 な 検 出が 加 わ れ ば, 次 元 が ひ とつ 高 ま る の で, そ
後 も追 及 され るで あ ろ う。
の 効 果 は はか り知 れ な い と思 う。
応 用 的 な面 につ い て は筆 者 は あ ま り的 確 に判 断 で きそ
Database Center for Life Science Online Service
うもな い が, た とえば 臨 床 検 査 を 筆 頭 とす る さ ま ざ ま な
お わ りに
生 化 学, 分 子 生 物 学 を お お い に 推 進 す るに
検 査 を 考 え る と, 出来 合 い の キ ッ トが な くて も, 気 軽 に
違 いな い 測 定 技 術 が, ま った くお 手 本 の な い と こ ろ か
イ ム ノ ア ッセ イ に匹 敵 す る検 査 が で き る よ うに な るだ ろ
ら, 新 た に生 み 出 され た の は, 久 しぶ りの こ とで は な い
う。 また バ イ オ に 関係 す る企 業 な ら, 多 種 多 様 な ス ク リ
だ ろ うか 。SPRの
ー ニ ン グへ 利 用 で き る はず で あ るか ら, や は りはか り知
した, ス ウ ェー デ ン の企 業 人 のパ イオ ニ ア精 神 に は 感 服
原 理 を 勇 気 を も って み ご とに実 体 化
れ な い 将 来 性 が あ る と思 う。
す る よ りない 。 ア イ デ アた だ 乗 りを 国 是 とす る ど こか の
経 済 大 国 では まず 行 な わ れ そ うに もな い こ とで, 悔 しい
VI.
か ぎ りで あ るが, せ め て これ を 多 面 的 に生 か すこ とで,
現 状 で の問 題 点
彼 ら に敬 意 を 表 し, 今 後 の さ らな る発 展 へ の支 持 とな し
1.
うる の では な い だ ろ うか 。
セ ンサ ー セ ル に 関 して
リガ ン ドを 固定 化 す る段 階 に制 約 が あ る。 現 在 の とこ
ろ は 支 持 体 と して使 え る の がCMデ
文
キ ス トラ ンだ け な
献
の で, 酸 性 物 質, た とえ ば核 酸 とか ム コ多 糖 を直 接 に 固
定 化 す る の は無 理 で あ る。 ほ ぼ確 実 な 固定 化 反 応 形 式 と
して は, III-2項
で述 べ た もの しか な か った が,
ご く最
近, 活 性 化 チ オ ー ル を利 用 す る方 法 も メ ー カ ーか ら公 表
され た の で, SH基
を 介す る 固定 化 も可 能 に な り, 少 し
1)
Otto,
2)
Kretschmann,
Z.
Phys.,
199
選 択 の余 地 を拡 大 す るの は, メー カ ー ば か りで な く, ユ
ーザ ー側 の努 力 と支 持 もお お い に 必要 だ ろ う
。
4)
Liedberg,
B.,
Sens.
5)
6)
Cullen,
Nylander,
7)
8)
イ オ セ ンサ ーは屈 折 率 の変 化 を検 出す る の で,
対 象 物 を標 識 す る必 要 が な い とい う大 き な利 点 が あ る
Mayo,
9)
S.,
Johnsson,
10)
Butt,
は, 固定 化 量 が 正 確 に 見 積 もれ な い。 ま た相 互 作用 を 見
H.:
J.
13)
Jost,
Dubs,
M.-C.,
Immunol..
Soc.
Lindquist,
Com
A.,
A.,
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19,
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12)
メ ー カ ー が 提 示 して い る実験 例 は, 抗体 を 使 った もの
2984
Lofas,
L.G.,
Kullman,
11)
B.:
Method,
Fagerstam,
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105
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(1987)
Hallock,
120,
Immunol.
う弱 み に つ な が って い る 。つ ま りモル 濃 度 の世 界 で は な
た い相 手 が低 分 子 だ と, 直 接 測 定 は むず か しい。
313
R.G.W.,
211
C.S.,
Lofas,
299
Brown,
3,
Biochem.,
が, そ れ を裏 返せ ば, 低 分 子 で は検 出感 度 が落 ち る とい
く, 重 量 濃 度 の 世 界 で あ る。 低 分 子 を 固定 化 した場 合 に
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241,
C.,
4,
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Methods,
検 出感 度 に つ い て
SPRバ
398
Phys.,
38,
Actuators,
mun.,21,
2.
Z.
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Biosensors,
も また 楽 しい はず)。 支 持 体 お よび 固定 化 法 につ い て,
216,
E.:
3) •¼Œ´•_Ži•1‘•• “ì –Î•v: •ªŒõŒ¤‹†,
選 択 の余 地 が ふ え た。 そ れ 以外 の方 法 でや ら ざ る を え な
い とき に は試 行 錯 誤 を重 ね る よ りな い (研究 者 な らそ れ
A.:
A.,
I.:
J.
Kar
Chro
(1992)
Andersson,
T.:
Nucleic
(1991)
D.,
Lett.,
Van
31,
Regenmortel,
59
(1991)
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