Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία και υπολειμματική νόσος. Από τις κατευθυντήριες οδηγίες στην ελληνική πραγματικότητα Μαριάννα Ν. Τζανουδάκη Είναι πλέον κοινός τόπος το ότι η κυτταρομετρία ροής αποτελεί πολύτιμο εργαλείο στη μελέτη της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας. Οι τελευταίες κατευθυντήριες οδηγίες που έχουν εκδοθεί από διαφόρους φορείς και ομάδες εργασίας βασίζονται στην ταξινόμηση της WHO του 2008 για τις αιματολογικές νεοπλασίες και έχουν ως στόχους: (1) την ανίχνευση παθολογικών βλαστικών πληθυσμών, (2) τη σαφή διάκρισή τους από τις φυσιολογικές προγονικές μορφές, (3) της ταυτοποίηση της κυτταρικής σειράς των βλαστών και την ταξινόμησή τους, (4) την ανεύρεση σχετιζόμενων με τη λευχαιμία ανοσοφαινοτυπικών χαρακτηριστικών (LAPs), με σκοπό τη μελλοντική διευκόλυνση της μελέτης της υπολειμματικής νόσου (MRD) και, τέλος, (5) τη μελέτη ορισμένων δεικτών με προγνωστική σημασία ή με συσχετίσεις με συγκεκριμένες μοριακές βλάβες. Κατά τη διάγνωση, προτείνεται η χρήση αρχικά ενός γενικού διερευνητικού πρωτοκόλλου, για τον καθορισμό της κυτταρικής σειράς των βλαστών, τα αποτελέσματα του οποίου υπαγορεύουν το εξειδικευμένο πρωτόκολλο που θα ακολουθηθεί. Όσον αφορά τη Β-ΟΛΛ, ορισμένοι προτεινόμενοι δείκτες, επιπλέον του παντού απαραίτητου CD45, είναι: CD19, CD10, CD22, CD79α, (καθορισμός σειράς, ταξινόμηση), CD34, CD20, cIgM, cκ, cλ, cTdT (ταξινόμηση, ανεύρεση LAPs), CD38, CD58, CD9, CD123, CD13, CD33, CD81, CD24 (ανεύρεση επιπλέον LAPs), CD66 (συσχέτιση με bcr abl). Όσον αφορά την Τ-ΟΛΛ προτείνεται αντίστοιχα η χρήση των cCD3 (ε-αλυσίδα, καθορισμός σειράς), CD7, CD2, CD5, CD1α, CD4, CD8, sCD3 (ταξινόμηση, ανεύρεση LAPs), cTdT, CD99, CD13 (αναγνώριση Τ-βλαστών, ανεύρεση επιπλέον LAPs). Η σημασία της μελέτης της MRD έχει πλέον αναβαθμιστεί, δεδομένου ότι, θεωρούμενη ως παράγοντας κινδύνου, χρησιμοποιείται στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων. Η αναγνώριση των LAPs κατά τη διάγνωση, σε συνδυασμό με τη γνώση των ανοσοφαινοτυπικών χαρακτηριστικών των φυσιολογικών προγονικών κυττάρων, είναι σημαντικά εργαλεία στη μέτρησή της. Όμως, το γεγονός ότι, τόσο στα βλαστικά, όσο και στα φυσιολογικά κύτταρα , η έκφραση ορισμένων δεικτών τροποποιείται με τα χημειοθεραπευτικά σχήματα θα πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη. Η μελέτη της MRD της Β-ΟΛΛ είναι καλύτερα μελετημένη και, παρόλη την αύξηση των προγονικών μορφών της Β-σειράς κατά την ανάπλαση του μυελού, ιδίως στα παιδιά, είναι σε γενικές γραμμές ευχερέστερη από εκείνη της Τ-ΟΛΛ Πολλά από τα διεθνή κατευθυντήρια πρωτόκολλα απαιτούν τη χρήση 8χρωμίας και προτείνουν την εφαρμογή ειδικών λογισμικών συστημάτων. Στον ελληνικό χώρο, όπου γίνεται χρήση κυρίως 4-5χρωμίας, αυτό είναι προς το παρόν ανέφικτο, και η μελέτη όλων των προτεινόμενων συνδυασμών δεικτών έχει, έτσι, υψηλό κόστος. Η σταδιακή μελέτη των δειγμάτων κατά τη διάγνωση (αν και χρονοβόρα) θα μπορούσε να μειώσει τον όγκο των χρησιμοποιούμενων αντιδραστηρίων. Επίσης, κατά τη μελέτη της MRD, η χρήση πρωτοκόλλων ειδικών για τον παθολογικό φαινότυπο της συγκεκριμένης διάγνωσης θα μπορούσε να περιορίσει το φάσμα των απαιτούμενων δεικτών. Όμως, παρά την επιβαλλόμενη από τις σημερινές συνθήκες μείωση των διαθέσιμων αντιδραστηρίων, δεν θα πρέπει να ξεχνά κανείς ότι η εξ’αρχής ορθή αντιμετώπιση ενός ασθενούς είναι ιδιαίτερα σημαντική και ότι η προσφυγή σε ενδιάμεσες λύσεις ανάγκης τελικά, μπορεί να είναι και οικονομικά ασύμφορη. ΑΠΟ ΤΙΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΤΗΡΙΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΚΑΙ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΙΚΗ ΝΟΣΟΣ Δημητρακοπούλου Λίλα Επιμ.Α΄Τμήμα Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας Γ.Ν.Α «Λαϊκό» Εισαγωγή Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία (ΟΜΛ) είναι μια κλωνική διαταραχή του προγονικού αιμοποιητικού κυττάρου (HSC) που χαρακτηρίζεται απο την επικράτηση άωρων κυττάρων με ελάχιστη ή καμμία ικανότητα ωρίμανσης. Η γενετική βλάβη μπορεί να συμβεί είτε στο επίπεδο του δεσμευμένου προς μια συγκεκριμένη κυτταρική σειρά κυττάρου (lineage commited) είτε στο επίπεδο του πολυδύναμου κυττάρου που μπορεί να διαφοροποιηθεί σε κύτταρο της μυελικής, μονοκυτταρικής, ερυθράς, μεγακαρυοκυτταρικής σειράς (multipotent stem cell) Η ΟΜΛ μπορεί να εμφανιστεί σε άτομα κάθε ηλικίας αλλά είναι πιο συχνή στους ενήλικες: 70-80% των περιπτώσεων οξείας λευχαιμίας στους ενήλικες είναι ΟΜΛ και η επίπτωση της αυξάνει με την ηλικία. Χαρακτηρίζεται από βιολογική, ανοσοφαινοτυπική, κυτταρογενετική και μοριακή ετερογένεια. Η τεράστια εξέλιξη των διαγνωστικών μεθόδων τα τελευταία χρόνια είχε σαν αποτέλεσμα την λεπτομερέστερη κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν στην λευχαιμογένεση. Σήμερα είναι αποδεκτό ότι οι γενετικές διαταραχές που οδηγούν σε λευχαιμία δεν είναι μόνο ετερογενείς αλλά και σύνθετες και ότι συνήθως πολλαπλές και διαδοχικές μεταλλάξεις είναι υπεύθυνες για έναν συγκεκριμένο λευχαιμικό φαινότυπο. Πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι σε πολλές περιπτώσεις αν και ανιχνεύονται αναδιατάξεις γόνων ( όπως RUNX1, CBFB, RARA) που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες υπεύθυνους για την αναστολή της φυσιολογικής μυελικής ωρίμανσης, είναι απαραίτητη και μια δεύτερη γενετική ανωμαλία (FLT3, KIT κλπ) για να επάγει τον πολ/σμό και την επιβίωση του παθολογικού κλώνου. Στη 3η έκδοση της κατάταξης WHO, 2001 για πρώτη φορά ενσωματώθηκαν γενετικές πληροφορίες σε συνδυασμό με μορφολογικές, κυτταροχημικές, ανοσοφαινοτυπικές και κλινικές πληροφορίες σε διαγνωστικούς αλγόριθμους για τα νεοπλάσματα μυελικής προέλευσης, ενώ στην 4η έκδοση της κατάταξης WHO το 2008, διευρύνθηκαν και ξεκαθάρισαν ακόμα περισσότερο οι ΟΜΛ που χαρακτηρίζονται από συγκεκριμένη γενετική διαταραχή, ενώ παρέμεινε αλλά συρρικνώθηκε η ομάδα που ακολουθεί την κατά FAB ταξινόμηση (AML NOS : 25-30% των ΟΜΛ). Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί εδώ και χρόνια πολύτιμο διαγνωστικό εργαλείο πρώτης γραμμής για την διάγνωση, ταξινόμηση και παρακολούθηση των ασθενών με ΟΜΛ. Η μεγάλη τεχνολογική εξέλιξη των τελευταίων χρόνων που έχει σαν αποτέλεσμα την ανακάλυψη νέων φθοριοχρωμάτων, την κατασκευή κυτταρομετρητών που έχουν την δυνατότητα να επεξεργάζονται τα δεδομένα χιλιάδων λευχαιμικών κυττάρων σε λίγο χρόνο σε συνδυασμό με την χρησιμοποίηση της πολυπαραμετρικής ανάλυσης μας δίνει την δυνατότητα να ανιχνεύουμε με μεγάλη ακρίβεια το ανοσολογικό αποτύπωμα συγκεκριμένων λευχαιμικών κυττάρων, να συσχετίσουμε ένα ανοσοφαινοτυπικό προφίλ με μια συγκεκριμένη γενετική διαταραχή και να ανιχνεύσουμε με μεγάλη ευαισθησία (< 1Χ10-4 ) υπολειμματική νόσο (MRD). Η κυτταρομετρία στην διάγνωση της ΟΜΛ Βασικό πλεονέκτημα της κυτταρομετρίας σε σύγκριση με τις υπόλοιπες διαγνωστικές μεθόδους (μορφολογία, κυτταρογενετική, μοριακή μελέτη) που εφαρμόζονται για την διάγνωση της ΟΜΛ, είναι η ταχύτητα (μέσα σε λίγες ώρες) και η ακρίβεια με την οποία αναγνωρίζεται ο βλαστικός πληθυσμός και χαρακτηρίζεται η σειρά στην οποία ανήκουν τα παθολογικά κύτταρα (μυελική, μονοκυτταρική, ερυθρά, μεγακαρυοκυτταρική ). Για την αναγνώριση του βλαστικού πληθυσμού χρησιμοποιείται αρχικά ένα στικτόγραμμα CD45/SSC στο οποίο αναγνωρίζονται τα βλαστικά κύτταρα απο την χαμηλότερη θέση που καταλαμβάνουν στο SSC σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα της μυελικής σειράς και την ασθενή έκφραση του CD45 σε σχέση με τα υπόλοιπα κύτταρα του δείγματος. Στη συνέχεια υπολογίζεται το ποσοστό των βλαστών στο σύνολο των κυττάρων του δείγματος για να καθοριστεί αν πρόκειται για ΟΜΛ η για άλλο μυελικό νεόπλασμα (MDS,MPN). Απαραίτητη προυπόθεση για να χαρακτηριστεί το νόσημα σαν ΟΜΛ είναι η ανεύρεση ποσοστού βλαστών >20% στο περιφερικό αίμα η στο μυελό. Εξαίρεση αποτελούν καποιες περιπτώσεις με συγκεκριμένες γενετικές ανωμαλίες όπως οι ΟΜΛ με t(15;17), t(8;21), inv(16) ή t(16;16), και μερικές περιπτώσεις ερυθρολευχαιμίας, όπου το ποσοστό των βλαστών δεν παίζει ρόλο στον χαρακτηρισμό της νόσου σαν ΟΜΛ. Τονίζεται ότι η μέθοδος έκλογής για τον υπολογισμό του ποσοστού των βλαστών είναι η μορφολογία και όχι η κυτταρομετρία. Ο υπολογισμός του ποσοστού των βλαστών με βάσει το ποσοστό των CD34+ κυττάρων δεν συνιστάται γιατί ενώ όλα τα κύτταρα που εκφράζουν CD34 είναι βλάστες, όλοι οι βλάστες δεν εκφράζουν CD34 (π.χ οι CD34- μονοβλάστες στην μονοκυτταρική λευχαιμία). Διάφοροι παράγοντες που αφορούν την τεχνική όπως η αραίωση του δείγματος με αίμα, η λύση των ερυθρών κατα την επεξεργασία των δειγμάτων και τα διάφορα artifacts μπορεί να οδηγήσουν σε λάθος υπολογισμό του ποσοστού διήθησης. Η πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής με την χρησιμοποίηση 3-4 χρωμάτων το λιγότερο, αποτελεί την μέθοδο εκλογής για τον χαρακτηρισμό της κυτταρικής σειράς στην οποία ανήκουν τα βλαστικά κύτταρα. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται συνδυασμοί MoAbs (panels) που περιέχουν δείκτες που χαρακτηρίζουν τα άωρα κύτταρα σε συνδυασμό με δείκτες που χαρακτηρίζουν την μυελική, την μονοκυτταρική , την ερυθρά και την μεγακαρυοκυτταρική σειρα. Το European LeukemiaNet προτείνει την χρησιμοποίηση μιας σειράς επιλεγμένων δεικτών ( πίνακας 1), για την διάγνωση της ΟΜΛ καθώς και της ΟΛ με μικτό φαινότυπο (MPAL: Mixed Phenotype Acute Leukemia) που αποτελεί ξεχωριστή ομάδα, στην κατάταξη WHO 2008 και αντικατέστησε τις λευχαιμίες που παλαιότερα χαρακτηρίζονταν σαν διφαινοτυπικές. Πίνακας 1 Δεν υπάρχει μια γενική σύσταση για το ποσοστό έκφρασης που καθορίζει την θετικότητα ενός δείκτη σε έναν βλαστικό πληθυσμό (cutt off point). Για τους περισσότερους δείκτες ένα κοινά αποδεκτό κριτήριο θετικότητας είναι η έκφραση του σε ποσοστό >20% των λευχαιμικών κυττάρων, ενώ κάποιοι επιλεγμένοι δείκτες (π.χ cytCD3, MPO, TdT, CD34, CD117) θεωρούνται θετικοί όταν εκφράζονται στο 10% των λευχαιμικών κυττάρων. Τελευταία με την χρήση της πολυπαραμετρικής ανάλυσης υπάρχει η τάση να εκτιμάται το συνολικό μοτίβο άτυπης έντασης φθορισμού του λευχαιμικού πλυθυσμού σε σχέση με την ένταση φθορισμού των ίδιων δεικτών στα αρνητικά κύτταρα του δείγματος. Η επιλογή των δεικτών που χρησιμοποιούμε στο panel διάγνωσης της ΟΜΛ εξαρτάται απο τα φθοριοχρώματα που έχουμε την δυνατότητα να μελετήσουμε ταυτόχρονα. Σε αρκετά κέντρα του εξωτερικού χρησιμοποιούνται πλέον στην ρουτίνα panel των 6-8 φθοριοχρωμάτων. Συνιστάται η χρησιμοποίηση το λιγότερο 3 η 4 φθοριοχρωμάτων και η τοποθέτηση σε όλα τα σωληνάρια του panel δύο τουλάχιστον δεικτών που χαρακτηρίζουν τον βλαστικό πληθυσμό όπως είναι το CD45 και το CD34. Προτείνεται αρχικά η χρησιμοποίηση ένός περιορισμένου panel με συνδυασμό δεικτών που θα ξεκαθαρίσουν αν πρόκειται για ΟΜΛ και στην συνέχεια με ένα πιο ευρύ panel δεικτών θα καθοριστεί σε πια σειρά ανήκει ο βλαστικός πληθυσμός (μυελική, μονοκυτταρική, ερυθρά η μεγακαρυοκυττάρική σειρά) καθώς και το στάδιο ωρίμανσης των λευχαιμικών κυττάρων και θα αναγνωριστούν διάφορα άτυπα πρότυπα έκφρασης αντιγόνων που χαρακτηρίζουν τα λευχαιμικά κύτταρα της ΟΜΛ. Ο πιο ειδικός δείκτης για την μυελική σειρά είναι η MPO. Ο δείκτης CD117 χαρακτηρίζει τους άωρους μυελοβλάστες, αλλά εκφράζεται και στα μαστοκύτταρα,ενώ αναφέρεται σπάνια η ανεύρεση του και στα βλαστικά κύτταρα κάποιων Τ-ΟΛΛ. Οι δείκτες CD13 και CD33 ενώ χαρακτηρίζουν τα κύτταρα της μυελικής σειράς μπορεί να εκφράζονται άτυπα και σε κάποιους βλάστες της Β-λεμφικής σειράς. Οι δείκτες CD15, CD16, CD11b εκφράζονται στα πιο ώριμα κύτταρα της μυελικής σειράς. Από τους δείκτες που χαρακτηρίζουν την μονοκυτταρική σειρά ο συνδυασμός CD36/CD64bright θεωρείται πιο ειδικός γιατί το CD14 μπορεί να μην εκφράζεται στούς μονοβλάστες. Ο ανοσοφαινότυπος θεωρείται απαραίτητος για την διάγνωση της ΟΜΛ με ελάχιστη διαφοροποίηση, της οξείας μεγακαρυοβλαστικής λευχαιμίας και της οξείας λευχαιμίας αδιευκρίνιστης σειράς. Στην ΟΜΛ με ελάχιστη διαφοροποίηση δεν υπάρχουν μορφολογικές και κυτταροχημικές αποδείξεις μυελικής διαφοροποίησης. Στις περισσότερες περιπτώσεις οι βλάστες εκφράζουν δείκτες αωρότητας (π.χ CD34, CD38, HLA-DR) και δεν εκφράζουν κανένα δείκτη μυελικής ή μονοκυτταρικής ωρίμανσης. Η MPO ενώ είναι αρνητική στην κυτταροχημική χρώση μπορεί να ανιχνεύεται κυτταροπλασματικά με κυτταρομετρία έστω σε ένα μικρό ποσοστό (<3%) των βλαστών. Η οξεία μεγακαρυοβλαστική λευχαιμία χαρακτηρίζεται απο την παρουσία >20% βλαστών εκ των οποίων >50% ανήκουν στην μεγακαρυοκυτταρική σειρά. Οι μεγακαρυοβλάστες εκφράζουν μία η περισσότερες απο τις γλυκοπρωτείνες των αιμοπεταλίων: CD41 ή/και CD61 και λιγότερο συχνά CD42. Τα αιμοπετάλια έχουν την τάση να προσκολλώνται στα μονοκύτταρα γι αυτό χρειάζεται προσοχή για την αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Ένας τρόπος αποφυγής τέτοιων λαθών είναι η ταυτόχρονη χρώση με τον συνδυασμό CD61/CD64 ή η κυτταροπλασματική χρώση του CD61. Οι οξείες λευχαιμίες αδιευκρίνιστης σειράς (acute leukemias of ambiguous lineage) είναι σπάνιες λευχαιμίες που περιλαμβάνουν περιπτώσεις που τα λευχαιμικά κύτταρα δεν εκφράζουν κανένα δείκτη διαφοροποίησης προς συγκεκριμένη σειρά (CD34+HLADR+CD38+/-lineage-, Οξεία αδιαφοροποίητη λευχαιμία, Acute undifferenciated leukemia, AUL) ή εκφράζουν δείκτες περισσοτέρων της μίας σειράς (μυελική+Β-λεμφική, μυελική + Τ λεμφική, μυελική +Β + Τ λεμφική, MPAL). Οι MPAL μπορεί να περιέχουν δύο ή περισσότερους διαφορετικούς βλαστικούς πληθυσμούς από διαφορετικές σειρές ή έναν βλαστικό πληθυσμό που εκφράζει δείκτες από διαφορετικές σειρές στο ίδιο κύτταρο. Τα ανοσοφαινοτυπικά κριτήρια για την διάγνωση τους είναι αυστηρά και φαίνονται στον πίνακα 1. Η κυτταρομετρία ροής είναι απαραίτητη επίσης για την διάγνωση του νεοπλάσματος απο βλαστικά πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα (blastic plasmatocytoid dendritic cell neoplasm) που παλιότερα ήταν γνωστό σαν CD4+/CD56+ αίματοδερμικό νεόπλασμα αλλά στην κατάταξη WHO 2008 ενσωματώθηκε στα νεοπλάσματα μυελικής προέλευσης. Πρόκειται για ένα σπάνιο και πολύ επιθετικό νόσημα που αρχικά εμφανίζεται με εστίες στο δέρμα και στην συνέχεια διηθεί το περιφερικό αίμα και τον μυελό. Ο βλαστικός πληθυσμός αυτού του νεοπλάσματος δεν εκφράζει ειδικούς δείκτες κάποιας σειράς (lineage - : MPO-, NSE -, cytCD3-, cyt CD22-) και χαρακτηρίζεται από την έκφραση CD4+, CD56+, CD123++, BDCA-2/CD303+ CD43+, HLA-DR++,TCL1+ και CLA+. Συχνά συνεκφράζονται οι δείκτες CD7 και CD33 και στο 30% των περιπτώσεων TdT, ενώ δεν εκφράζονται οι δείκτες αωρότητας CD34 και CD117. Ο ανοσοφαινότυπος είναι απαραίτητος επίσης για την εκτίμηση της έκφρασης δεικτών που αποτελούν στόχους συγκεκριμένης θεραπείας (targeted therapy) όπως π.χ η εκτίμηση της έκφρασης του CD33 στα βλαστικά κύτταρα της ΟΜΛ σε ασθενείς που πρόκειται να χορηγηθεί αντι- CD33 MoAb (gentuzumab ozogamicin). Η μεγάλη ετερογένεια που χαρακτηρίζει την ΟΜΛ αντανακλάται και στην μεγάλη ποικιλία άτυπων προτύπων έκφρασης αντιγόνων που συναντάμε στον ανοσοφαινότυπο των λευχαιμικών κυττάρων. Για την σωστή αναγνώριση των άτυπων ανοσοφαινοτύπων απαραίτητη προϋπόθεση είναι η λεπτομερής γνώση της φυσιολογικής έκφρασης των δεικτών στα διάφορα στάδια ωρίμανσης στον φυσιολογικό μυελό. Οι συχνότερες ατυπίες που περιγράφονται στην ΟΜΛ είναι : 1) ασύγχρονη έκφραση δεικτών δηλαδή ταυτόχρονη έκφραση άωρων και ώριμων δεικτών στο ίδιο κύτταρο.(π.χ συνέκφραση του CD34 και του CD15) 2) έκφραση ενός δείκτη άλλης κυτταρικής σειράς δηλαδή έκφραση δεικτών της λεμφικής σειράς στους βλάστες της μυελικής σειράς (π.χ συνέκφραση CD2, CD5, CD7, CD10, CD19) 3) υπερέκφραση ενός δείκτη, δηλαδή παθολογικά αυξημένη έκφραση ενός αντιγόνου. 4) απουσία έκφρασης ειδικών για την κυτταρική σειρά αντιγόνων (π.χ απουσία του CD13 ή/και του CD33 από τους μυελοβλάστες. 5) μη αναμενόμενα σκεδαστικά χαρακτηριστικά (π.χ έκφραση λεμφικών δεικτών σε κύτταρα με ψηλό FSC/SSC που αντιστοιχούν στα φυσιολογικά κύτταρα της μυελικής σειράς) Η αναγνώριση των άτυπων προτύπων έκφρασης δεικτών που χαρακτηρίζουν τα λευχαιμικά κύτταρα της ΟΜΛ είναι απαραίτητη για τον καθορισμό του σχετιζόμενου με την λευχαιμία ανοσοφαινότυπου (Leukemia Associated Immunophenotype- LAIP) στην διάγνωση (πίνακας 3). Η χρησιμοποίηση της πολυπαραμετρικής ανάλυσης έδειξε ότι σε κάθε ασθενή με ΟΜΛ μπορεί να αναγνωριστούν πάνω από ένας LAIP. Οι LAIP που ανιχνεύονται στην διάγνωση πρέπει να καταγράφονται γιατί αποτελούν το «ανοσολογικό αποτύπωμα» της συγκεκριμένης ΟΜΛ το οποίο χρησιμεύει για την παρακολούθηση του ασθενούς και την ανίχνευση υπολειμματικής νόσου (MRD) όπως θα δούμε παρακάτω. Εκτός από τους δείκτες που χαρακτηρίζουν την σειρά και το στάδιο ωρίμανσης των λευχαιμικών κυττάρων, στο panel διάγνωσης της ΟΜΛ συνιστάται να περιλαμβάνονται και δείκτες άλλων σειρών που η συνεκφράση τους στα βλαστικά κύτταρα της ΟΜΛ έχει συσχετισθεί είτε με την πρόγνωση είτε με κάποια συγκεκριμένη γενετική διαταραχή. Τέτοιοι δείκτες είναι οι : CD2, CD7, CD56, CD19, NG2. Κάποιες ΟΜΛ με ειδικές χρωμοσωμιακές ανωμαλίες (AML with recurrent genetic abnormalities) σχετίζονται με χαρακτηριστικά ανοσοφαινοτυπικά προφίλ (πίνακας 2). Για παράδειγμα, η συχνή έκφραση του CD19 (ή/ και του CD56 και TdT ) στην ΟΜΛ με t(8:21), η έκφραση του CD2 στην ΟΜΛ με inv(16) και στην variant μορφή της ΟΠΛ με t(15;17), η έκφραση του NG2 ομόλογου (που συνδέεται με το 7.1 MoAb) στις περισσότερες περιπτώσεις των 11q23 ΟΜΛ. Τα τελευταία χρόνια γίνεται προσπάθεια συσχέτισης της έκφρασης όχι μόνο δεικτών απο άλλες σειρές αλλά συγκεκριμένων άτυπων ανοσοφαινοτυπικών προφίλ με υποκείμενες χρωμοσωμιακές ανωμαλίες. Για παράδειγμα, η έκφραση CD13+,CD33++,MPO+,CD117-/+,CD34-/dim,HLA-DR-CD15-,CD11b- πληθυσμό με ψηλό SSC, είναι χαρακτηριστική σε έναν βλαστικό της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας με t(15;17)q(22;q22), η ανεύρεση CD34-, HLA-DR–, (και συχνά CD56+,CD123+,CD133-) ανοσοφαινότυπου σε συνδυασμό με συγκεκριμένα μορφολογικά χαρακτηριστικά (cup-shaped nuclear invaginations) και αρνητικό καρυότυπο έχει συσχετισθεί με FLT3-ITD+, ενώ η ανεύρεση CD33++CD34-/dim παρατηρείται συχνά στην NPM1+ ΟΜΛ . Πίνακας 2 Η ταχύτατη αναγνώριση τέτοιων χαρακτηριστικών ανοσοφαινοτυπικών προφίλ με την κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμεύσει σαν screening που θα βοηθήσει αφενός μεν στην λήψη γρήγορων θεραπευτικών αποφάσεων όπως στην περίπτωση της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας που συνήθως εμφανίζεται σαν επείγον περιστατικό, αφετέρου δε στο να κατευθύνει την μοριακή μελέτη για την αναζήτηση συγκεκριμένων μεταλλάξεων που σχετίζονται με την πρόγνωση και την επιλογή της κατάλληλης θεραπείας. Προς το παρόν λόγω της μικρής ειδικότητας και ευαισθησίας που οφείλεται κυρίως στην έλλειψη προτύπωσης της μεθόδου, η κυτταρομετρία δεν είναι το κατάλληλο εργαλείο για την ανίχνευση των γενετικών ανωμαλιών στην ΟΜΛ. Η κυτταρομετρία στην ανίχνευση ελαχίστης υπολειμματικής νόσου (MRD) Οι ασθενείς με ΟΜΛ έχουν περίπου 1012 λευχαιμικά κύτταρα στην διάγνωση. Σαν πλήρης μορφολογική ύφεση (CR) χαρακτηρίζεται η ανίχνευση μορφολογικά <5% λευχαιμικών κυττάρων στον μυελό μετά την χημειοθεραπεία. Όμως μπορεί να παραμένουν περίπου 1010 λευχαιμικά κύτταρα που η ευαισθησία της μορφολογίας και της κυτταροχημείας δεν μπορεί να ανιχνεύσει. Περίπου 80% των ασθενών με ΟΜΛ εμφανίζουν μορφολογική ύφεση μετά την χημειοθεραπεία, αλλά τουλάχιστον 30% των ασθενών αυτών θα εμφανίσει υποτροπή, που οφείλεται στην παραμονή μικρού υπολειμματικού πληθυσμού λευχαιμικών κυττάρων που δεν ανιχνεύονται με την μορφολογία (Minimal Residual Disease,MRD). Είναι αναγκαίος λοιπόν ο καθορισμός πιο ευαίσθητων κριτηρίων για τον χαρακτηρισμό της ύφεσης και η παρακολούθηση της MRD αποκτά όλο και μεγαλύτερη σημασία για την πρόγνωση και την καθοδήγηση της θεραπείας. Η πιο ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης MRD είναι η RQ-PCR με ευαισθησία απο 10-4 έως 10-6 (δηλ. ανίχνευση 1 λευχαιμικού κυττάρου σε 10.000 έως 1.000.000 φυσιολογικά κύτταρα). Όμως ευαίσθητοι μοριακοί δείκτες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ανίχνευση MRD υπάρχουν περίπου στο 60% των ασθενών με ΟΜΛ. Το μεγάλο πλεονέκτημα της χρησιμοποίησης της πολυπαραμετρικής κυτταρομετρίας ροής στην ανίχνευση MRD είναι ότι μπορεί να εφαρμοστεί σε όλους σχεδόν τους ασθενείς με ΟΜΛ ανεξάρτητα από την συνυπαρξη ή όχι γενετικών διαταραχών. Άτυπη έκφραση αντιγόνων (LAIP) ανιχνεύεται σχεδόν σε όλους τους ασθενείς με ΟΜΛ και αρκετοί μάλιστα από αυτούς έχουν >1 LAIP κατά την διάγνωση (πίνακας 3). Η ανίχνευση της MRD με κυτταρομετρία ροής παρουσιάζει κάποιες δυσκολίες που οφείλονται κυρίως στην ετερογένεια της ΟΜΛ και στο γεγονός ότι μέχρι σήμερα δεν έχει προτυπωθεί πλήρως ούτε ο ποιοτικός ούτε ο ποσοτικός προσδιορισμός της. Απαραίτητη προϋπόθεση για την ανίχνευση της MRD αποτελεί η αναγνώριση τών LAIP για κάθε ασθενή κατά την διάγνωση και η επιλογή του ή των πιό κατάλληλων LAIP για την παρακολούθηση. Πινακας 3 Η ποιότητα ενός LAIP εξαρτάται από τα εξής χαρακτηριστικά : 1) Ειδικότητα: ένας LAIP θεωρείται ειδικός όταν το ποσοστό έκφρασης του στον φυσιολογικό ή στον αναγεννόμενο μετά θεραπεία μυελό είναι <0,1%. 2) Ευαισθησία : ένας LAIP θεωρείται υψηλής ευαισθησίας όταν το ποσοστό έκφρασης του στα λευχαιμικά βλαστικά κύτταρα είναι >50% (μέσης ευαισθησίας : 20-50%, χαμηλής ευαισθησίας:1020%) 3) Σταθερότητα : οι LAIP μπορεί να υποστούν φαινοτυπική τροποποίηση, δηλαδή κατα την διάρκεια της νόσου η έκφραση (ιδιαίτερα η ασθενής έκφραση) κάποιων δεικτών μπορεί να χαθεί (π.χ η έκφραση του CD19 συχνά εξαφανίζεται). Συγκριτικά με την οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ), οι LAIP στην ΟΜΛ είναι πιο ετερογενείς και συχνά παρατηρούμε την συνύπαρξη αρκετών βλαστικών πληθυσμών με διαφορετικό LAIP στον ίδιο ασθενή. Στην περίπτωση αυτή για την παρακολούθηση της MRD θα πρέπει να επιλέγεται ο LAIP που εμφανίζει την μεγαλύτερη λογαριθμική διαφορά σε σχέση με τον φυσιολογικό μυελό. Επίσης ο λογάριθμος του πηλίκου της % αναλογίας των LAIP+ κυττάρων στην διάγνωση και % αναλογίας των LAIP+ κυττάρων στην επανεκτίμηση (log difference, LD) είναι πιο κατάλληλος δείκτης από την απλή % αναλογία των LAIP+ κυττάρων για την εκτίμηση της ελάττωσης του λευχαιμικού φορτίου μετά την θεραπεία. Για να πετύχουμε ευαισθησία της τάξεως του 1Χ 10-4 θα πρέπει να μετρήσουμε τουλάχιστον 250000 κύτταρα (2-5 Χ 105 λευκοκύτταρα), ενώ για να αυξηθεί η ευαισθησία κατά 1-log θα πρέπει να μετρηθούν 10 φορές περισσότερα κύτταρα. Η δυνατότητα αυτή παρέχεται μεν από τους νέους ψηφιακούς κυτταρομετρητές μετρώντας διαδοχικά πολλά σωληνάρια με τον ίδιο συνδυασμό μονοκλωνικών και αποθηκεύοντας τα δεδομένα στον ίδιο φάκελο, αλλά αυτή η διαδικασία αυξάνει κατά πολύ το κόστος της εξέτασης και δεν είναι πρακτικά εφαρμόσιμη στα εργαστήρια ρουτίνας. Τα τελευταία χρόνια αρκετές κλινικές μελέτες σε μεγάλες ομάδες ασθενών, διερευνούν την αξία της πολυπαραμετρικής κυτταρομετρίας ροής στην παρακολούθηση της MRD στην ΟΜΛ. Τα αποτελέσματα αυτών δείχνουν την ανεξάρτητη προγνωστική σημασία της ανίχνευσης MRD με κυτταρομετρία ροής κατά την διάρκεια και μετά το τέλος της θεραπείας. Αντικείμενο συζητήσεων παραμένει σε πια χρονική στιγμή κατά την θεραπεία έχει την μεγαλύτερη προγνωστική αξία καθώς και το ποσοστό θετικής MRD που έχει ισχυρότερη συσχέτιση με την κλινική έκβαση. Κάποιες μελέτες αποδεικνύουν ότι η ανίχνευση MRD μετά την θεραπεία εδραίωσης φαίνεται να έχει ισχυρότερη προγνωστική αξία από την ανίχνευση μετά την θεραπεία εφόδου και μπορεί να αναγνωρίσει ασθενείς που θα ωφεληθούν από διαφορετικές θεραπευτικές προσεγγίσεις όπως π.χ αλλογενή μεταμόσχευση. Επίσης σε άλλες μελέτες η ανίχνευση MRD νωρίς της πρώτες οκτώ μέρες της θεραπείας ή στην φάση της απλασίας μετά την πρώτη θεραπεία εφόδου, φάνηκε να χρησιμεύει στην αναγνώριση των ασθενών που έχουν υψηλό κίνδυνο να μην ανταποκριθούν στην θεραπεία. Ταυτόχρονα άλλες κλινικές μελέτες επικεντρώνονται στην αναζήτηση δεικτών που εκφράζονται αποκλειστικά στα πρόδρομα κακοήθη λευχαιμικά κύτταρα (LSC: Leukemia stem cells) και όχι στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα στον αναγεννόμενο μυελό και που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην ανίχνευση MRD με κυτταρομετρία ροής. Τέτοιος δείκτης είναι το μόριο CLL-1 που φαίνεται να εκφράζεται ειδικά στον υποπληθυσμό CD34+CD38- των κακοήθων λευχαιμικών κυττάρων σε όλες τις CD34+ΟΜΛ και που η αναζήτηση του θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανίχνευση MRD και ίσως στο μέλλον στην εφαρμογή στοχευμένης θεραπείας με την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Οι μελλοντικές προσπάθειες διεθνώς έχουν στόχο την προτύπωση των panel των μονοκλωνικών που χρησιμοποιούνται για την διάγνωση της ΟΜΛ (ήδη γίνεται μια τέτοια προσπάθεια απο το European LeukemiaNet), την αναγνώριση των πιο κατάλληλων LAIP για την παρακολούθηση της MRD και τον σαφή καθορισμό του κατώτατου ορίου MRD που θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επιλογή της κατάλληλης θεραπευτικής στρατηγικής σε κάθε ασθενή καI συγχρόνως την αναζήτηση δεικτών που θα χαρακτηρίζουν τα LSC με σκοπό την ευρύτερη εφαρμογή στοχευμένης θεραπείας. Στην Ελλάδα του σήμερα, που στις ήδη υπάρχουσες οργανωτικές και λειτουργικές δυσκολίες των νοσοκομείων, έρχεται να προστεθεί και η πίεση των διοικήσεων για ελάττωση του κόστους των εξετάσεων θα πρέπει ίσως να επανεξετάσουμε τους τρόπους με τους οποίους θα ήταν δυνατόν αυτό να γίνει εξασφαλίζοντας ταυτόχρονα και την καλύτερη ποιότητα παροχής υπηρεσιών προς τον ασθενή. Σε νοσήματα όπως οι λευχαιμίες που η σωστή και έγκαιρη διάγνωση τους έχει τεράστια σημασία για την ζωή του ασθενούς η μείωση του κόστους δεν θα πρέπει να γίνεται εις βάρος της διαγνωστικής αξίας της εξέτασης. Η χρήση περισσότερων φθοριοχρωμάτων μπορεί να ελαττώνει τον χρόνο της επεξεργασίας των δειγμάτων και να αυξάνει την ακρίβεια τον αποτελεσμάτων αλλα σίγουρα δεν οδηγεί σε μείωση του κόστους. Η χρησιμοποίηση των screening panels αρχικά και στην συνέχεια ευρύτερων πιο στοχευμένων panels και η σωστή συνεργασία κλινικής εργαστηρίου είναι παράγοντες που μπορεί να βοηθήσουν στην ελάττωση του κόστους. Η συνεργασία των εργαστηρίων επίσης για θέματα που αφορούν τον αριθμό και το είδος των δεικτών που πρέπει να περιλαμβάνονται στα panel διάγνωσης καθώς και τις χρονικές στιγμές στην διάρκεια της παρακολούθησης (ανάλογα με το θεραπευτικό πρωτόκολλο) που μπορεί να έχει πραγματική προγνωστική αξία και θεραπευτική σημασία η ανίχνευση MRD με κυτταρομετρία συγκριτικά με άλλες τεχνικές μπορεί να έχει σαν αποτέλεσμα την συνολική ελάττωση των παραγγελόμενων εξετάσεων. Ισως τώρα λοιπών είναι αναγκαία, όσο ποτέ άλλοτε, η προώθηση συνεργασιών μεταξύ μας, η χρησιμοποίηση μιας κοινής γλώσσας και κοινών πρωτοκόλλων και ίσως η διερεύνηση της δυνατότητας δημιουργίας κέντρων αναφοράς ιδιαίτερα για εξετάσεις όπως η ανίχνευση MRD που πρακτικά είναι δύσκολο να εφαρμοστούν στα εργαστήρια ρουτίνας. Βιβλιογραφία 1. Craig E. F, et al: Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood, 2008, 111: 3941-3967 2. Vardiman W. J, et al: The 2008 revision of the World Health Organisation (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important shanges. Blood, 2009, 114: 937-951. 3. Dohner H, et al: Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood, 2010, 115: 453-474. 4. Campana D. et al: Role of Minimal Disease Evaluation in Leukemia Therapy. Current Hematologic Malignancy Reports. 2008, 3: 155-160. 5. Al-Mawali A., et al: The role of Multiparameter Flow Cytometry for Detection of Minimal Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. AJCP, 2009, 131:16-26. 6. Al-Mawali A., et al: Incidence, Sencitivity and Specificity of Leukemia-Associated Phenotypes in Acute Myeloid Leukemia Using Specific Five-Color Multiparameter Flow Cytometry. AJCP, 2008, 129:934-945. 7. Kern W.,et al: The role of multiparameter flow cytometry for disease monitoring in AML. Best Practise & Research Clinical Haematology, 2010, 23:379-390 8. Nomdedeu J., et. al: Immunophenotype of acute leukemia with NPM mutations: Prognostic impact of the leukemic compartment size. Leukemia Research 2011, 35:163-168. 9. Munoz L., et. al: Immunophenotypic findings in acute myeloid leukemia with FLT3 internal tandem duplications. Haematologica 2003, 88 (06). 10.Bene MC., et al: Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia, 2011,25 : 567-574. Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα-Κατευθυντήριες οδηγίες Μαρίνα Καρακάντζα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας και Αιμοδοσίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν κλωνικές διαταραχές του προγονικού αιμοποιητικού κυττάρου, που χαρακτηρίζονται από ποικίλου βαθμού αναστολή ωρίμανσης και διαφοροποίησης, αυξημένο ρυθμό προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωση) σε όλες τις κυτταρικές βαθμίδες με αποτέλεσμα μη αποδοτική αιμοποίηση (1). Τα νοσήματα αυτά μολονότι έχουν αρκετούς κοινούς παθογενετικούς μηχανισμούς, εμφανίζουν σημαντική κλινική και αιματολογική ετερογένεια, η οποία εκδηλώνεται με ποικίλους συνδυασμούς κυτταροπενιών στο αίμα, ποικίλου βαθμού ανάγκες υποστήριξης παραγώγων αίματος και ποικίλο ποσοστό εξέλιξης σε περισσότερο επιθετικό κλινικό σύνδρομο ή οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ) (2,3). Η ετερογένεια αυτή πιθανώς είναι αποτέλεσμα του διαφορετικού βαθμού συμμετοχής κάθε παθογενετικού μηχανισμού στην ανάπτυξη του συνδρόμου, του διαφορετικού τρόπου ‘αντίδρασης’ του ανοσοποιητικού συστήματος στην εμφάνιση και ανάπτυξη ενός νεοπλασματικού νοσήματος και του διαφορετικού λοιπού νοσολογικού υποστρώματος κάθε ασθενούς. Παρά τη συνεχή έρευνα της παθογένειας των νοσημάτων αυτών με σύγχρονες και προηγμένες τεχνολογίες και τη συσσώρευση πλήθους πληροφοριών για τις γενετικές και λειτουργικές βλάβες των κυττάρων τα ισχύοντα συστήματα κατάταξης και πρόγνωση των ΜΔΣ δεν αξιοποιούν τα δεδομένα αυτά. Η διεθνής επιστημονική κοινότητα έχει από καιρό αναγνωρίσει ότι οι υπότυποι των ΜΔΣ όπως αυτοί ορίζονται με μορφολογικά κριτήρια και οριοθετούν τις ομάδες συνδρόμων των εν ισχύει ταξινομήσεων, δεν συσχετίζονται ικανοποιητικά με τα κλινικά χαρακτηριστικά, την ανταπόκριση στην θεραπεία και την πρόγνωση των ασθενών. Γι αυτό γίνονται συνεχείς προσπάθειες αναθεώρησης των κριτηρίων διάγνωσης και κατάταξης των συνδρόμων με σκοπό την ενσωμάτωση και άλλων δεικτών ώστε η αρχική κατάταξη να αντανακλά καλύτερα την παθογένεια των νοσημάτων. Όλο και περισσότερο αναγνωρίζεται η σημασία των κυτταρογενετικών και μοριακών ευρημάτων στη διάγνωση και πρόγνωση των ΜΔΣ. Στην τελευταία ταξινόμηση κατά WHO αναγνωρίζονται υποκατηγορίες ασθενών κατά την διάγνωση βάση κυτταρογενετικών διαταραχών ανεξαρτήτως άλλων κριτηρίων (4). Πρόσφατες δημοσιεύσεις αναδεικνύουν την σημασία της ανίχνευσης μοριακών διαταραχών με νέες τεχνικές όπως SNPs και microarrays στην διάγνωση και παρακολούθηση των ΜΔΣ, διαταραχές που πιθανώς θα ενσωματωθούν σε επόμενες διαγνωστικές και προγνωστικές κατατάξεις. (5,6,7,8) 2. ΚΑΤΕΥΘΥΝΤΗΡΙΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΙΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΧΡΗΣΗΣ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ ΣΤΑ ΜΔΣ Ο ρόλος της κυτταρομετρίας ροής στην διάγνωση και πρόγνωση των ΜΔΣ παραμένει αμφισβουτούμενος. Σε ασθενείς με ΜΔΣ τα ευρήματα της κυτταρομετρία ροής αναδεικνύουν διαταραχές στην έκφραση των αντιγόνων σε διάφορα στάδια ωρίμανσης όλων των αιμοποιητικών σειρών και κυρίως της μυελικής σειράς. Οι διαταραχές αυτές αφορούν ασυγχρονίες έκφρασης αντιγόνων για το στάδιο ωρίμανσης κυρίως των κυττάρων της μυελικής και ερυθράς σειράς, άτυπες (aberrant) εκφράσεις αντιγόνων άλλων σειρών και παθολογική υπερέκφραση ή υποέκφραση αντιγόνων. Συγκεντρωτική καταγραφή από το Leukemia EuroNet των παρατηρούμενων διαταραχών στην έκφραση αντιγόνων στα ΜΔΣ δημοσιεύθηκε πρόσφατα φαίνεται στους πίνακες 1,2, και 3 (9). Για να θεωρηθεί ένας αντιγονικός συνδυασμός παθογνωμονικός για τα ΜΔΣ πρέπει να έχει μεγάλη ειδικότητα και ευαισθησία, να εμφανίζεται δηλαδή με μεγάλη συχνότητα σε ασθενείς με ΜΔΣ και με πολύ χαμηλή ή μηδενική συχνότητα σε ασθενείς με άλλα νοσήματα. Από την υπάρχουσα καταγραφή (πίνακας 2) φαίνεται ότι ο πιο ευαίσθητος δείκτης για τα ουδετερόφιλα με συχνότητα εμφάνισης σχεδόν 100% είναι τα παθολογικά σκεδαστικά, ενώ οι ασυγχρονίες των αντιγόνων CD13/CD11b και CD16/CD13 καθώς και οι άτυπες εκφράσεις των αντιγόνων CD2 CD7, CD5, CD19 εμφανίζονται με συχνότητα >70%. Ωστόσο, οι διαταραχές της αντιγονικής έκφρασης δεν έχουν ενσωματωθεί στα διαγνωστικά κριτήρια της WHO επειδή δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς σε δευτεροπαθή ΜΔΣ και δεν έχει αποδειχθεί η παθογνωμονική τους σημασία για τη διαφορική διάγνωση πρωτοπαθών και δευτεροπαθών ΜΔΣ από άλλες νοσολογικές οντότητες με ανάλογα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα (4). Επιπλέον η ανάλυση των αντιγονικών αυτών διαταραχών στα ΜΔΣ είναι πολύπλοκη διότι συχνά αφορά την ανάλυση παθολογικών pattern και όχι απλών αποκλίσεων και απαιτεί εξειδίκευση και ερμηνευτικές τεχνικές πέραν των διαθέσιμων καθιστώντας την ενσωμάτωση τους στα διαγνωστικά κριτήρια προβληματική. Κατά συνέπεια βάση της δημοσιευμένης εμπειρίας δεν είναι δυνατόν να ορισθούν κατευθυντήριες οδηγίες για τις κλινικές ενδείξεις εφαρμογής της κυτταρομετρίας ροής στην διάγνωση και παρακολούθηση των ΜΔΣ για γενικευμένη χρήση. Σε εξειδικευμένα εργαστήρια η δημοσιευμένη εμπειρία δείχνει ότι η κυτταρομετρία ροής συμπληρώνει την μορφολογική και κυτταρογενετική διάγνωση των ΜΔΣ στις υποκατηγορίες των ΜΔΣ χαμηλού κινδύνου. 2.1 Παθογνωμονική σημασία του ανοσοφαινότυπου για τα ΜΔΣ 2.1.1 Ανθεκτικές Κυτταροπενίες με δυσπλασία μίας σειράς (Refractory cytopenias unilineage dysplasia , RCUD)) Στην WHO κατάταξη του 2001 αναγνωρίσθηκε η διαφορά επιβίωσης και κινδύνου μετατροπής σε λευχαιμία των ασθενών που εμφανίζουν δυσπλασία μίας σειράς σε σχέση με αυτούς που εμφανίζουν δυσπλασία 2 ή περισσότερων σειρών (10). Η ανίχνευση παθολογικών αντιγονικών συνδυασμών με κυτταρομετρία ροής φαίνεται από μελέτες ότι δεν επιβεβαιώνει απλώς τη διάγνωση που τίθεται από την μορφολογία και τα κυτταρογενετικά ευρήματα αλλά συμπληρώνει την διάγνωση (11, 12) Σε πρόσφατη μελέτη, ασθενείς οι οποίοι με μορφολογικά κριτήρια κατατάχθηκαν ως πάσχοντες από ανθεκτική αναιμία όταν μελετήθηκαν με κυτταρομετρία ροής αποδείχθηκε ότι σε ποσοστό >50% είχαν διαταραχές και της μυελικής σειράς (11). Αυτή η διαφοροποίηση ήταν κλινικά σημαντική και σχετίζονταν με την εξέλιξη και την πρόγνωση των ασθενών. 2.1.2 Μεμονωμένες κυτταροπενίες αδιευκρίνιστης σημασίας ( Isolated cytopenias of undetermined significance , ICUS) Σύμφωνα με την τελευταία κατάταξη της WHO οι μεμονωμένες κυτταροπενίες αδιευκρίνιστης σημασίας ορίζονται από την κυτταροπενία μίας σειράς χωρίς κυτταρογενετικά ευρήματα ενδεικτικά ΜΔΣ και με δυσπλαστικά χαρακτηριστικά <10%. . Υπάρχουν μελέτες που δείχνουν ότι σε ασθενείς με ICUS ανιχνεύονται διαταραχές στην αντιγονική έκφραση των κυττάρων της μυελικής σειράς ανάλογες με αυτές που παρατηρούνται σε ΜΔΣ διαχωρίζοντας έτσι υποομάδες που εντάσσονται παθογενετικά στο φάσμα των ΜΔΣ και τους διαφοροποιούν από άλλες νοσολογικές οντότητες (13, 14, 15, 16). 3. ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ 3.1 Πιθανή παθογνωμονική σημασία ανοσοφαινοτύπου για ΜΔΣ Ιδιοπαθής δυσπλασία αδιευκρίνιστης σημασίας Idiopathic dysplasia of undetermined significance, IDUS) Η ιδιοπαθής δυσπλασία αδιευκρίνιστης σημασίας είναι μία οντότητα που ενώ εμφανίζει μορφολογικές διαταραχές χαρκτηριστικές ΜΔΣ δεν εμφανίζει κυτταροπενίες. Θεωρείται πρό –ΜΔΣ με άγνωστη κλινική Αταξινόμητα ΜΔΣ (MDS-U) Στην WHO κατάταξη του 2008 χαρακτηρίζονται ως αταξινόμητα ΜΔΣ αυτά που εμφανίζουν δυσπλασία <10% μίας σειράς και κυτταρογενετικά ευρήματα ενδεικτικά ΜΔΣ. Αν και δεν υπάρχουν δεδομένα που να τεκμηριώνουν την σημασία του ανοσοφαινοτύπου στις παραπάνω οντότητες είναι πιθανόν ότι η συμπλήρωση της μορφολογικής και κυτταρογενετικής μελέτης με ανοσοφαινότυπο θα προσθέσει πληροφορίες που θα τις εντάξει σε καλύτερα αναγνωρισμένες οντότητες Μεμονωμένη έλλειψη 5q- (del 5q-) Η μεμονωμένη έλλειψη 5q- αποτελεί ξεχωριστή υποκατηγορία των ΜΔΣ που χαρακτηρίζεται από αναιμία, φυσιολογικό ή αυξημένο αριθμό αιμοπεταλίων και χαμηλή πιθανότητα εκτροπής σε Οξεία Μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ). Πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ασθενείς με del 5q- εμφανίζουν περισσότερες διαταραχές στην έκφραση των αντιγόνων από ομάδες ασθενών με άλλες κυτταρογενετικές βλάβες όπως τρισωμία 8, del(20q) και απώλεια χρωμοσώματος Y (17) Η ανοσοφαινοτυπική μελέτη των ασθενών αυτών μπορεί να βοηθήσει στην διάκριση υποκατηγορίας ασθενών με παθολογική αντιγονική έκφραση και αυξημένο κίνδυνο εκτροπής σε ΟΜΛ. 3.2 Σημασία του ανοσοφαινότυπου στην πρόγνωση των ΜΔΣ Το διεθνώς ισχύον προγνωστικό σύστημα IPSS ( International Prognostic Scoring System) για τον καθορισμό ομάδων που θα έχουν δυσμενή κλινική πορεία και θα εξελιχθούν σε οξεία λευχαιμία στηρίζεται σε κριτήρια κατά την διάγνωση που έχουν συμπεριληφθεί στις κατατάξεις της WHO και επιπλέον σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες που δε συμπεριλαμβάνονται στα διαγνωστικά κριτήρια. Οι χρωμοσωμικές αυτές ανωμαλίες θεωρούνται δευτεροπαθείς, εμφανιζόμενες κατά την εξέλιξη του κλώνου, και προβλέπουν την εξέλιξη σε ΟΜΛ (18). Μειονέκτημα του IPSS είναι ότι κατατάσσει τους ασθενείς κατά την διάγνωση και δεν συμπεριλαμβάνει παραμέτρους που εμφανίζονται κατά την πορεία της νόσου. Πιο δυναμικό σύστημα είναι το WHO-adjusted prognostic scoring system (WPSS) που περιλαμβάνει την εξάρτηση από μεταγγίσεις κατά την πορεία της νόσου και έτσι εισάγει μία κλινική παράμετρο που αντικαθρεπτίζει την βιολογική εξέλιξη του νοσήματος (19). Και τα δύο συστήματα, IPSS και WPSS, μειονεκτούν διότι δεν συμπεριλαμβάνουν νέες σημαντικές παραμέτρους που φαίνεται ότι σχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου όπως συννοσηρότητα, επίπεδα LDH, κατάσταση μεθυλίωσης , ίνωση μυελού των οστών κ.α. Τα συστήματα αυτά είναι συνεχώς σε αναθεώρηση με σκοπό αφενός την ενσωμάτωση νέων βιολογικών παραμέτρων και αφετέρου τον εκσυγχρονισμό τους σε σχέση με νέες θεραπείες. Η ανίχνευση παθολογικών αντιγονικών εκφράσεων σε άωρα και ώριμα κύτταρα με κυτταρομετρία ροής πιθανόν να βελτιώσει την προγνωστική δύναμη των ισχυόντων συστημάτων ιδιαίτερα σε υποκατηγορίες ΜΔΣ χαμηλού κινδύνου. Στις υποκατηγορίες RCUD, ICUS, MDS-U, IDUS, isolated del5q- η μελέτη των αντιγόνων μπορεί να συμπληρώσει τα ευρήματα της μορφολογίας και κυτταρογενετικής και να κατατάξει τους ασθενείς σε υποκατηγορίες μεγαλύτερο κινδύνου. Επιπλέον οι παθολογικές αντιγονικές έκφρασεις σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κυττάρων μπορεί να έχουν ανεξάρτητη προγνωστική σημασία. Μελέτες έδειξαν ότι διαταραχές της αντιγονικής έκφρασης της μυελικής και μονοκυτταρικής σειράς συσχετίζονται με το International Prognostic Scoring System (IPSS), το WHO-adjusted prognostic scoring system (WPSS), την εξάρτηση από μεταγγίσεις , τον χρόνο εξέλιξης σε ΟΜΛ και την έκβαση μεταμόσχευσης αιμοποιητικών κυττάρων (20, 21). Άτυπες εκφράσεις αντιγόνων στα προγονικά κύτταρα της μυελικής σειράς πχ υπερέκφραση ή μειωμένη έκφραση κοινών μυελικών αντιγόνων ή έκφραση αντιγόνων άλλης σειράς μπορεί να έχουν ανεξάρτητη προγνωστική σημασία ακόμα και αν ο αριθμός των βλαστών στον μυελό των οστών είναι < 5%.(20-23). Έχει δειχθεί ότι η άτυπη έκφραση κάποιων δεικτών όπως του CD7 και/ή TdT) στα άωρα κύτταρα της μυελικής σειράς συσχετίζεται με χειρότερη κλινική έκβαση (20, 24, 25) Η ανίχνευση διαταραχών έκφρασης αντιγόνων στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα μπορεί να έχει διαγνωστική και προγνωστική σημασία και στις ομάδες ασθενών με περίσσεια βλαστών. Στην ανθεκτική αναιμία με περίσσεια βλαστών , RAEB-1 και RAEB-2, όπως αυτή ορίζεται με μορφολογικά και κυτταρογενετικά κριτήρια οι διαταραχές έκφρασης αντιγόνων τόσος στα πρόδρομα όσο και στα ώριμα κύτταρα της μυελικής και μονοκυτταρικής σειράς μπορεί να μεταβάλλουν την διάγνωση και να έχουν προγνωστική σημασία για τους ασθενείς αυτούς. 3.3 Σημασία του ανοσοφαινότυπου στην παρακολούθηση ασθενών των ΜΔΣ Κανένα από τα ισχύοντα προγνωστικά συστήματα δεν μπορεί να προβλέψει την ανταπόκριση των ασθενών με ΜΔΣ στην θεραπεία. Σε πρόσφατη μελέτη φάνηκε ότι η ανίχνευση άτυπου φαινοτύπου σε πρόδρομα κύτταρα της μυελικής σειράς ασθενών με χαμηλού και ενδιαμέσου κινδύνου-1 ΜΔΣ προβλέπει την ανταπόκριση σε αυξητικούς παράγοντες. Έτσι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα Ερυθροποιητίνης(EPO) και φυσιολογική έκφραση αντιγόνων στα πρόδρομα κύτταρα της μυελικής σειρά ανταποκρίνονται στην χορήγηση EPO και G-CSF (94%)ενώ ασθενείς με υψηλά επίπεδα EPO και παθολογική έκφραση αντιγόνων δεν ανταποκρίνονται στην χορήγηση αυξητικών παραγόντων (11%)(26, 27). Σε άλλη μελέτη φάνηκε ότι ο βαθμός φωσφορυλίωσης της pERK όπως αυτή ανιχνεύεται με κυτταρομετρία ροής σχετίζεται με την ανταπόκριση στην EPO και την συνολική επιβίωση ασθενών με χαμηλού και ενδιαμέσου κινδύνου -1 ΜΔΣ. (28) Παρακολούθηση ασθενών με κυτταρομετρία ροής μπορεί να είναι σημαντική αφενός για την αναγνώριση νέων παθολογικών αντιγονικών εκφράσεων κατά την εξέλιξη της νόσου ή την απώλεια των παθολογικών αντιγονικών εκφράσεων μετά από ανταπόκριση σε θεραπεία, ιδιαίτερα για ασθενείς που αντιμετωπίζονται με υπομεθυλιωτικούς παράγοντες όπως 5-αζασυτιδίνη.(29) 4. ΚΑΤΕΥΘΥΝΤΗΡΙΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΣΗΜΑΝΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΜΔΣ Οι διαταραχές της έκφρασης των αντιγόνων σε ασθενείς με ΜΔΣ εμφανίζουν εντυπωσιακή επαναληψιμότητα και είναι διακριτές για κάθε στάδιο ωρίμανσης της αιμοποίησης. Η σχέση των αντιγονικών αυτών συνδυασμών με άλλες διαγνωστικές παραμέτρους ή με τους παθογενετικούς μηχανισμούς εμφάνισης της νόσου ή εξέλιξης της σε ΟΛ είναι άγνωστη. Τα παθολογικά σκεδαστικά των ουδετερόφιλων πιθανώς αποτελούν δείκτη των μορφολογικών διαταραχών που χαρακτηρίζουν τα ΜΔΣ ενώ οι ατυπίες στην έκφραση αντιγόνων σχετίζονται με την παθολογική ωρίμανση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων και πιθανώς αποτελούν δείκτες υποκείμενων παθογενετικών μηχανισμών. 4.1 Πρόταση European LeukeniaNet για διαγνωστική προσέγγιση των ΜΔΣ Τον Μάρτιο του 2008, αντιπρόσωποι 18 Ευρωπαϊκών Κέντρων, 3 Κέντρων της Αμερικής και 1 της Ιαπωνίας με μεγάλη εμπειρία στην ανοσοφαινοτύπιση των ΜΑΣ στα πλαίσια των εργασιών του Euronet LeukemiaNet αφού ανέλυσαν ερωτηματολόγια που είχαν συμπληρωθεί από 15 από τα 22 συμμετέχοντα Κέντρα έδωσαν οδηγίες για όλα τα στάδια προετοιμασίας και ανάλυσης των δειγμάτων και έθεσαν τα ερωτήματα τα οποία πρέπει να απαντηθούν ώστε να αξιολογηθεί η διαγνωστική σημασία της κυτταρομετρίας στα νοσήματα αυτά (9). Κατά συνέπεια ενώ κατευθυντήριες οδηγίες για τις κλινικές ενδείξεις χρήσης της κυτταρομετρίας στα ΜΔΣ είναι αμφισβητούμενες οι κατευθυντήριες οδηγίες για τις τεχνικές που πρέπει να ακολουθηθούν είναι λεπτομερείς και γενικά αποδεκτές. 4.1.1 Δείγματα Η ανάλυση με κυτταρομετρία ροής πρέπει να γίνεται σε δείγματα μυελού των οστών διότι δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα από ανάλυση περιφερικού αίματος. Τα δείγματα πρέπει να συλλέγονται κατά προτίμηση σε ηπαρίνη με δεύτερη επιλογή το EDTA γιατί το EDTA επηρεάζει την έκφραση των αντιγόνων CD16, CD11b CD64, CD10. 4.1.2 Να αναλύονται κατά προτίμηση σε 24 ώρες. Αν πρέπει να φυλαχθούν συνιστάται αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου και προσθήκη καλλιεργητικού υλικού (1:1) που να περιέχει γλυκόζη. 4.1.3 Λύση ερυθρών Συνιστάται λύση των ερυθρών πριν την σήμανση με χλωριούχο αμμώνιο χωρίς μονιμοποιητικό. Η λύση μπορεί να γίνει • με ανάμιξη 3ml μυελού των οστών με χλωριούχο αμμώνιο σε τελικό όγκο 50 ml, επώαση 10 min σε θερμοκρασία δωματίου • πλύσιμο των κυττάρων με PBS με προσθήκη 0,5% βόειδιο ή ανθρώπινη αλβουμίνη (washing solution) • Φυγοκέντρηση σε 300g • Επαναιώρηση των κυττάρων στο washing solution. Άλλα εμπορικά λυτικά διαλύματα χωρίς μονιμοποιητικό μπορούν να χρησιμοποιηθούν. 4.1.4 Σήμανση με αντισώματα Συνιστάται σήμανση 500.000 κυττάρων /σωληνάριο Τα αντισώματα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε ιδανικές συγκεντρώσεις, μετά από τιτλοποίηση. Εφόσον πρέπει να αραιωθούν αυτό πρέπει να γίνει σε washing solution Επώαση 15 min σε θερμοκρασία σωματίου στο σκοτάδι. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για tandem φθοροχρώματα που είναι πολύ ευαίσθητα στο φώς. Μετά την επώαση πρέπει τα κύτταρα να πλυθούν τουλάχιστον μία φορά με washing solution. Μετά την επιφανειακή σήμανση και εφόσον δεν ακολουθήσει ενδοκυττάρια χρώση τα κύτταρα πρέπει να μονιμοποιηθούν. Η μονιμοποίηση πρέπει να γίνει με εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια , 0,5% παραφορμαλδεύδη (PFA) σε PBS (pH 7.4). Τα κύτταρα δεν πρέπει να αποθηκευθούν αλλά αμέσως να αναλυθούν. Η μονιμοποίηση αυτή δεν μεταβάλλει τα σκεδαστικά των κυττάρων. Εάν ακολουθήσει ενδοκυττάρια χρώση πρέπει να χρησιμοποιηθούν εμπορικά αντιδραστήρια που έχουν αξιολογηθεί επαρκώς για αυτήν την χρήση. Μετά την επώαση ακολουθεί πλύσιμο των κυττάρων. Επειδή πολλά μονιμοποιητικά των αντιδραστηρίων για ενδοκυττάρια χρώση μεταβάλουν τα σκεδαστικά των κυττάρων δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται τα χαρακτηριστικά των κυττάρων μετά από ενδοκυττάρια χρώση για ορισμό των δυσπλαστικών κυττάρων. 4.1.5 Κυτταρομετρητής Οι κυτταρομετρητές πρέπει να ρυθμίζονται σύμφωνα με τις ισχύουσες οδηγίες. 4.1.6 Συνδυασμοί μονοκλωνικών αντισωμάτων. Στον πίνακα 4 συνοψίζεται η πρόταση της European LeikemiaNet για τους απαραίτητους συνδυασμούς αντισωμάτων ώστε να προσδιορισθούν οι δυσπλαστικοί πληθυσμοί σε κάθε στάδιο ωρίμανσης. Σε κάθε συνδυασμό προστίθεται και το CD45 βάσει του οποίου θα γίνει η ανάλυση. Στον πίνακα αυτό δεν καθορίζεται ο αριθμός των χρωμάτων που πρέπει να χρησιμοποιηθεί αλλά από τους προτεινόμενου συνδυασμούς και την προσθήκη του CD45 προϋποθέτει την χρήση τουλάχιστον 3 χρωμάτων. Στους πίνακες 5 και 6 φαίνεται η πρόταση για συνδυασμό 4 ή 5 χρωμάτων. 4.1.7 Ανάλυση Ανάλυση των άωρων κυττάρων της μυελικής και λεμφικής σειράς 4.1.7.1 Ορισμός και καταμέτρηση βλαστών. Η ταυτοποίηση των μυελοβλαστών γίνεται από τον συνδυασμό CD45dim/SSlow (βλαστικό παράθυρο). Η διαφοροποίηση τους από τα αιματογόνια, τους λεμφοβλάστες, τα βασεόφιλα, τα πρόδρομα δενδριτικά κύτταρα και τους μονοβλάστες γίνεται με τους συνδυασμούς CD45/CD34/CD117/HLA-DR και CD45/CD34/CD123/HLA-DR Στην καταμέτρηση των μυελοβλαστών πρέπει να έχουμε υπόψιν μας ότι συχνά το ποσοστό των βλαστών όπως αυτοί καταμετρούνται από τη κυτταρομετρία είναι χαμηλότερο από το ποσοστό των βλαστών που αναγνωρίζονται στα επιχρίσματα μυελού των οστών. Αυτό συμβαίνει διότι τα δείγματα μυελού για κυτταρομετρία περιέχουν λιγότερα κοκκία μυελού από τα επιχρίσματα συνήθως λόγω αραίωσης με περιφερικό αίμα. Επιπλέον ο ορισμό των βλαστών διαφέρει μεταξύ μορφολογίας και κυτταρομετρίας. Στην κυτταρομετρία αποκλείονται από την ανάλυση οι λεμφοβλάστες, μονοβλάστες και τα αιματογόνια ενώ στην μορφολογία οι πληθυσμοί αυτοί συχνά καταμετρούνται μαζί. Σπάνια οι βλάστες στα ΜΔΣ δεν εκφράζουν CD34 με αποτέλεσμα την δυσκολία ταυτοποίησης τους αν δεν χρησιμοποιείται ταυτόχρονα εναλλακτικό αντιγόνο πχ CD117. Για τους παραπάνω λόγους το ποσοστό βλαστών που θεωρείται παθολογικό για την κυτταρομετρία ροής είναι το 3% σε αντίθεση με την μορφολογία που είναι το 5%. Ταυτόχρονα καταμετρούνται τα άωρα κύτταρα της Β λεμφικής σειράς με βάση την έκφραση των CD34/CD19/CD10. Η μείωση των κυττάρων αυτών στα ΜΔΣ δεν έχει αξιολογηθεί κλινικά και δεν είναι γνωστό αν τα χαρακτηρίζει ή αν οφείλεται στην ηλικία των ασθενών. 4.1.7.2 Άτυπη έκφραση αντιγόνων στους βλάστες. Μετά την καταμέτρηση τους οι βλάστες αναλύονται για άτυπες εκφράσεις αντιγόνων. Στον πίνακα 1 αναφέρεται η συχνότητα άτυπης ή παράδοξης έκφρασης αντιγόνων στους μυελοβλάστες των ασθενών με ΜΔΣ. 4.1.7.3 Ανάλυση έκφρασης αντιγόνων σε κύτταρα ενδιάμεσης και τελικής ωρίμανσης της μυελικής σειράς Τα ώριμα κοκκιοκύτταρα ορίζονται από την έκφραση του CD45 ενδιάμεση και του SS έντονο Στα ΜΔΣ η πιο συνηθισμένη διαταραχή είναι η μείωση της κοκκίωσης των κοκκιοκυττάρων που είναι ένα βασικό διαγνωστικό μορφολογικό κριτήριο και στην κυτταρομετρία εκφράζεται με ελάττωση του SS των ουδετερόφιλων. Στον πληθυσμό αυτών εμφανίζεται άτυπη έκφραση αντιγόνων όπως αυτή φαίνεται στον πίνακα 2. Προσοχή χρειάζεται στην ερμηνεία των ευρημάτων της κυτταρομετρίας ροής σε σχέση με την διάγνωση των ΜΔΣ. Η ελάττωση του SS μπορεί να δυσκολεύει την διάκριση του πληθυσμού των ουδετερόφιλων από αυτόν των μονοπυρήνων. Στην περίπτωση αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί η έκφραση του CD33 για την διάκριση των ουδετερόφιλων από τα μονοπύρηνα (CD33 dim, CD33 bright, αντίστοιχα). Για την ερμηνεία της άτυπης έκφρασης αντιγόνων πρέπει να λαμβάνεται υπόψιν ότι το EDTA μεταβάλλει την έκφραση αντιγόνων των οποίων η έκφραση είναι Ca εξαρτώμενη, όπως του CD11b. Δείγματα που δεν σημαίνονται άμεσα μπορεί να ενεργοποιηθούν και να μεταβληθεί η έκφραση των αντιγόνων CD64 και HLA-DR. Επιπλέον η έκφραση ορισμένων αντιγόνων όπως CD16, CD11b, CD64 και HLA-DR μπορεί να σχετίζεται με την επιλογή των κλώνων των MoAb που χρησιμοποιούνται. Η υπερέκφραση του CD56 δεν είναι απαραίτητα παθολογική; μπορεί να σχετίζεται με τη χρήση G-CSF ή την αναγέννηση του μυελού. Κατά συνέπεια η ειδικότητα των μεταβολών αυτών για τα ΜΔΣ πρέπει να αποδειχθεί. 4.1.7.4 Ανάλυση έκφρασης αντιγόνων σε κύτταρα ενδιάμεσης και τελικής ωρίμανσης της μονοκυτταρικής σειράς Τα μονοκύτταρα ορίζονται με βάση την έκφραση του CD45 και SS και επιπλέον τους δείκτες CD14, CD36, CD64, CD55. Το CD14 δεν πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο του καθώς εμφανίζεται όψιμα στην διαφοροποίηση και πιθανώς υποτιμά τον μονοκυτταρικό πληθυσμό ιδιαίτερα παρουσία πρόδρομων μονοκυττάρων. Οι άτυπες εκφράσεις αντιγόνων στον μονοκυτταρικό πληθυσμό φαίνονται στον πίνακα 2. Χρήσιμος επίσης είναι ο συνδυασμός IREM2 και CD14 για την διαφοροποίηση των φυσιολογικών από τα λευχαιμικά μονοκύτταρα. Φυσιολογικά το CD14 εκφράζεται πριν το IREM2 ενώ σε λευχαιμικά μονοκύτταρα η διαδοχή αυτή μπορεί να αναστραφεί. 4.1.7.5 Ανάλυση έκφρασης αντιγόνων σε κύτταρα της ερυθράς σειράς. Τα κύτταρα της ερυθράς σειράς ορίζονται από την έλλειψη έκφρασης CD45, το low SS και την έκφραση αντιγόνων CD235a και CD71. Η έκφραση των αντιγόνων C105 σε συνδυασμό με το C117 και CD56 μπορεί να διαφοροποίησει την φυσιολογική από δυσπλαστική αιμοποίηση (πίνακας 3). Η έκφραση της M-φερριτίνης φαίνεται ότι σχετίζεται με την παρουσία δακτυλοειδών ερυθροβλαστών. Συμπερασματικά, δεν υπάρχουν ακόμα σαφείς κλινικές ενδείξεις για την χρήση κυτταρομετρίας στην διάγνωση των ΜΔΣ. Τα υπάρχοντα δημοσιευμένα δεδομένα δείχνουν ότι η χρήση της θα συμπληρώσει τις διαθέσιμες διαγνωστικές τεχνικές της κυτταρομορφολογίας και κυτταρογενετικής για την ακριβέστερη διάγνωση κυρίως των ΜΔΣ χαμηλού κινδύνου και των αδιευκρίνιστων κυτταροπενιών . Η ανίχνευση παθολογικών αντιγονικών συνδυασμών σε άωρα και ώριμα αιμοποιητικά κύτταρα μπορεί να αποτελέσουν δείκτες παρακολούθησης της εξέλιξης της νόσου και ανταπόκρισης στη θεραπεία. Πρέπει να επισημανθεί ότι τα ΜΔΣ αποτελούν μία εξαιρετικά ετερογενή ομάδα νοσημάτων ενώ η ανάλυση των δεδομένων της κυτταρομετρίας με τις σύγχρονες τεχνικές είναι εξαιρετικά πολύπλοκη, απαιτεί εμπειρία στην κυτταρομετρία και εξειδίκευση στα ΜΔΣ. Για να γενικευθεί η χρήση της απαιτείται προτύπωση τεχνικών και ανάλυσης και αξιολόγηση τους βάση κλινικών δεδομένων σε προσεκτικά σχεδιασμένες μελέτες για να μπορέσει να εισαχθεί στην καθημερινή κλινική πράξη με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα. Επιλεκτική βιβλιογραφία 1. Giagounidis, A.A., U. Germing, and C. Aul, Biological and prognostic significance of chromosome 5q deletions in myeloid malignancies. Clin Cancer Res, 2006; 12: 5-10. 2. Malcovati, L., et al., Prognostic factors and life expectancy in myelodysplastic syndromes classified according to WHO criteria: a basis for clinical decision making. J Clin Oncol, 2005; 23: 7594-603. 3. Valent, P., et al., Definitions and standards in the diagnosis and treatment of the myelodysplastic syndromes: Consensus statements and report from a working conference. Leuk Res, 2007; 31: 727-36. 4. Vardiman, J.W., et al The 2008 revision criteria of the World Health Organization (WHO)of myeloid neoplasms and acute leukemia : rationale and important changes Blood, 2009; 11: 937-951. 5. Langemeijer SM, et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet 2009; 41:838-42. 6. Hussein K, et al. Aberrant microRNA expression pattern in myelodysplastic bone marrow cells. Leuk Res 2010; 34:1169-74. 7. Dostalova MM, et al. Distinctive microRNA expression profiles in CD34+ bone marrow cells from patients with myelodysplastic syndrome. Eur J Hum Genet 2010 Dec 8. 8. Flach J, et al. An accumulation of cytogenetic and molecular genetic events characterizes the progression from MDS to secondary AML: an analysis of 38 paired samples analyzed by cytogenetics, molecular mutation analysis and SNP microarray profiling. Leukemia 2011 Jan 14. 9. van de Loosdrecht, A.A., et al., Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: report from the first European LeukemiaNet working conference on flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Haematologica, 2009; 94: 1124-34. 10. Vardiman, J.W., N.L. Harris, and R.D. Brunning, The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood, 2002; 100: 2292-302. 11. van de Loosdrecht AA, et al. Identification of distinct prognostic subgroups in low- and intermediate-1-risk myelodysplastic syndromes by flow cytometry. Blood 2008; 111:1067-77. 12. Bacher, U., et al., The impact of cytomorphology, cytogenetics, molecular genetics, and immunophenotyping in a comprehensive diagnostic workup of myelodysplastic syndromes. Cancer, 2009; 115: 4524-32. 13. Stachurski, D., et al., Flow cytometric analysis of myelomonocytic cells by a pattern recognition approach is sensitive and specific in diagnosing myelodysplastic syndrome and related marrow diseases: emphasis on a global evaluation and recognition of diagnostic pitfalls. Leuk Res, 2008; 32: 215-24. 14. Papadaki H., et al., P039 The diagnostic utility of bone marrow flow-cytometric immunophenotyping for the differential diagnosis of chronic idiopathic neutropenia from myelodysplastic syndromes. Leukemia Research, 2009; 33: S80-S81 15. Truong, F, et al. The utility of flow cytometric immunophenotyping in cytopenic patients with a non-diagnostic bone marrow: a prospective study. Leuk Res, 2009; 33: 1039-46. 16. Stetler-Stevenson, M., Flow cytometric immunophenotyping: emerging as an important diagnostic tool in the evaluation of cytopenic patients. Leuk Res, 2009; 33: 1020-1. 17. Cutler JA, et al. Phenotypic abnormalities strongly reflect genotype in patients with unexplained cytopenias. Cytometry B Clin Cytom 2010 Dec 23. 18. Greenberg P et al International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic syndromes. Blood 1997;89: 2079-88 19. Malcovati L, et al. Time depending prognostic scoring system for predicting survival and leukemia evolution in myelodysplastic syndromes. J Clin Oncol 2007; 25: 3503-10 20. van de Loosdrecht AA, et al. Identification of distinct prognostic subgroups in low- and intermediate-1-risk myelodysplastic syndromes by flow cytometry. Blood 2008; 111:1067-77 21. Wells DA, et al. Myeloid and monocytic dyspoiesis as determined by flow cytometric scoring in myelodysplastic syndrome correlates with the IPSS and with outcome after hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2003; 102:394-403. 22. Ogata K, et al. Diagnostic application of flow cytometric characteristics of CD34+ cells in low-grade myelodysplastic syndromes. Blood 2006; 108:1037-44. 23. Scott BL, et al. Validation of a flow cytometric scoring system as a prognostic indicator for posttransplantation outcome in patients with myelodysplastic syndrome. Blood 2008; 112:2681-6. 24. Ogata K, et al. Clinical significance of phenotypic features of blasts in patients with myelodysplastic syndrome. Blood 2002;100:3887-96. 25. Font P, et al. Evaluation of CD7 and terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) expression in CD34+ myeloblasts from patients with myelodysplastic syndrome. Leuk Res 2006; 30:957-63. 26. Westers TM, et al. Aberrant immunophenotype of blasts in myelodysplastic syndromes is a clinically relevant biomarker in predicting response to growth factor treatment. Blood 2010; 115: 177984. 27. Westers TM, et al. Quantitative Dynamics of Flow Cytometric Aberrancies during Treatment with Erythropoietin/G-CSF are predictive for Responses in Low/Int-1 Risk Myelodysplastic Syndromes. Blood 2008; 112, 586. Ref Type: Abstract 28. Frisan E, et al. p-ERK1/2 is a predictive factor of response to erythropoiesis-stimulating agents in low/int-1 myelodysplastic syndromes. Haematologica 2010; 95:1964-8. 29. Silverman LR, et al. Continued azacitidine therapy beyond time of first response improves quality of response in patients with higher-risk myelodysplastic syndromes. Cancer 2011 Jan 10 Πίνακας 1 Παράμετροι με άτυπη έκφραση στα άωρα κύτταρα Μυελοβλάστες Άυξηση ποσοστού Ανωμάλη σκέδαση SSC Άτυπη έκφραση CD45 Άτυπη έκφραση CD13 Άτυπη έκφραση CD33 Άτυπη έκφραση CD34 Άτυπη έκφραση CD117 Έκφραση CD11b Έκφραση CD15 Άτυπη έκφραση HLA-DR Έκφραση CD36 Άτυπη έκφραση TdT Έκφραση CD41/CD42b/CD61 Έκφραση CD38 Έκφραση CD4 Έκφραση CD2 Έκφραση CD5 Έκφραση CD7 Έκφραση CD19 Έκφραση CD56 Εμφάνιση Ποσοστό % 91 73 100 100 100 91 82 82 64 55 45 36 36 27 18 82 82 91 91 91 Πρόδρομα Β κύτταρα Αύξηση ποσοστού Μείωση ποσοστού Ποσοστό % 42% 82% Πίνακας 2 Παράμετροι με άτυπη έκφραση στα κύτταρα ενδιάμεσης και τελικής ωρίμανσης κύτταρα της μυελικής σειράς Μείωση λόγου μυελικής/λεμφική σειράς Εμφάνιση Ποσοστό % 36 Άτυπη σκέδαση SSC Άτυπη έκφραση CD45 Στροφή προς τα αριστερά Άτυπη έκφραση CD13/CD16 Άτυπη έκφραση CD16/CD11B Άτυπη έκφραση CD33 Έκφραση CD34 100 Άτυπη έκφραση CD15 Έκφραση HLA-DR Άτυπη έκφραση CD36 Άτυπη έκφραση/ή έλλειψη έκφρασης CD10 55 Άτυπη έκφραση CD64 Άτυπη έκφραση CD66 Άτυπη έκφραση CD16 Έκφραση CD2 Έκφραση CD5 Έκφραση CD7 Έκφραση CD19 Έκφραση CD56 36 64 82 82 73 73 73 73 45 45 Μονοκύτταρα Μείωση ή αύξηση λόγου μονοκυτταρικής /λεμφική σειράς Άτυπη σκέδαση SSC Άτυπη έκφραση CD45 Άτυπη έκφραση CD33 Έκφραση HLA-DR Άτυπη έκφραση CD11b/HLA-DR Έκφραση CD34 Άτυπη έκφραση CD14 Άτυπη έκφραση CD13 Άτυπη έκφραση CD36 Άτυπη έκφραση CD64 Άτυπη έκφραση CD11c Εμφάνιση Ποσοστό % 45 45 55 73 73 73 73 73 73 45 36 18 Άτυπη έκφραση CD15 9 Έκφραση CD2 Έκφραση CD5 Έκφραση CD7 Έκφραση CD19 Έκφραση CD56 73 73 73 73 91 27 9 73 73 82 82 45 Πίνακας 3 Παράμετροι με άτυπη έκφραση στα κύτταρα της ερυθράς σειράς Κύτταρα ερυθράς σειράς Αυξημένο ποσοστό ερυθροβλαστών μετά από λύση Ανώμαλη κοκκίωση (SS) Άτυπη έκφραση του CD235a Άτυπη έκφραση CD71 Άτυπη συνέκφραση CD71/CD235a Άτυπη έκφραση CD117 Άτυπη έκφραση CD36 Άτυπη έκφραση CD34 Άτυπη έκφραση CD105 Άτυπη έκφραση M φερριτίνη Άτυπη έκφραση H φερριτίνη Εμφάνιση Ποσοστό % 45 45 64 71 64 55 36 45 36 18 18 Πίνακας 4 : Προτεινόμενοι συνδυασμοί δεικτών για τη μελέτη δυσπλασίας στα ΜΔΣ με κυτταρομετρία ροής Δείκτες Ερυθρά σειρά CD71, CD235a, CD117 X CD105 (X) CD34,CD117 (X) Άωρα Μυελικής σειράς Άωρα λεμφικής σειράς Ώριμα Κοκκιοκύτταρα Μονοκύτταρα X X CD11b, CD117 CD11b, HLA-DR X CD117, HLA-DR X CD123, HLA-DR (x)† (x)‡ CD34, CD15 X X CD34, CD5 X X X CD34, CD7, (CD13§) X X X CD34, CD56 X X X CD34, CD19 X X X X CD10, CD19 (X) X CD10, CD38 (X) X CD11b, CD13, CD16 X X (x) CD65 CD64, CD14 X CD64, CD36 (X) CD33, CD14 CD33, CD36 TdT CD79a Ώριμα λεμφοκύτταρα X (x) CD36 X X (X) X X (X) (X) CD19 k,l (x)** CD3, CD4, CD8 (x)** *CD45 είναι παρόν σε κάθε συνδυασμό. X : απαραίτητος συνδυασμός (x) :Συμπληρωματικός συνδυασμός. † Ανάλυση πλασμοκυτταρικών DC (προγονικών κυττάρων), ‡ Ανάλυση βασεόφιλων, §CD7 έκφραση στους μυελοβλάστες μπορεί να είναι φυσιολογικήl, πχ σε πρόδρομα κύτταρα μονοκυτταρικής/ δενδριτικής διαφοροποίησης (CD13dim/CD7dim), ** για να ολοκληρωθεί η μελέτη των λεμφοκυτταρικών πληθυσμών Πίνακας 5 : Παράδειγμα συνδυασμών 4-χρωμάτων για μελέτη ΜΔΣ με κυτταρομετρία ροής FL-1 Fl-2 1 FL-3 FL-4 CD45 2 CD71 CD235a CD45 CD117 3 CD36 CD64 CD45 CD14 4 CD10 CD33 CD45 CD14 5 CD16 CD13 CD45 CD11b 6 HLA-DR CD117 CD45 CD11b 7 CD13+CD33 CD117 CD45 CD34 8 CD13 CD7 CD45 CD34 9 CD2 CD56 CD45 CD34 10 CD5 CD19 CD45 CD34 11 CD15 CD11b CD45 CD34 ό το panel βασίσθηκε σε πρόταση της Ολλανδικής ομάδας μελέτης των ΜΔΣ με κυτταρομετρία ς. χεδιασμός εξαρτάται από τον εξοπλισμό του κάθε Εργαστηρίου, τα διαθέσιμα MoAb, ροχρώματα και την εμπειρία των χρηστών. Πίνακας 6 : Παράδειγμα συνδυασμών 5 χρωμάτων 1 2 3 4 5 6 7 FITC CD10 HLADr CD7 MPO CD36 CD16 CD3 PE CD19 CD33 CD117 LF CD64 CD13 CD(16+56) ECD CD34 CD34 CD34 CD34 CD34 CD5 CD4 PC5 CD20 CD38 CD13 CD16 CD14 CD11b CD8 PC7 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 CD45 Παροξυσμική Νυκτερινή Αιμοσφαιρινουρία (PNH) - Κατευθυντήριες οδηγίες για τη διάγνωση και παρακολούθηση της νόσου με Κυτταρομετρία Ροής Α. Καραμούτσιος Χημικός, Επιστημονικός Συνεργάτης, Αιματολογικό Εργαστήριο - Μονάδα Μοριακής Βιολογίας, Π.Γ.Ν. Ιωαννίνων Εισαγωγή Η PNH είναι μία σπάνια διαταραχή του αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου που έχει υποστεί μια σωματική μετάλλαξη στο PIG-A γονίδιο με κλινικά χαρακτηριστικά που ποικίλουν ανά ασθενή κατά την πορεία της νόσου. Κύρια κλινικά χαρακτηριστικά είναι α) η ενδαγγειακή αιμόλυση η οποία προκαλεί διάφορες κλινικές εκδηλώσεις όπως δυσφαγία, λήθαργο, ΧΝΑ, πνευμονική υπέρταση, αναιμία, αιμοσφαιρινουρία, β) η θρομβoφιλική διάθεση τόσο στα άκρα όσο και σε άλλες ανατομικές περιοχές (ήπαρ, σπλήνα, μεσεντεριές φλέβες) και γ) η ανεπάρκεια του μυελού των οστών η οποία εκδηλώνεται σε ένα μεγάλο βαθμό των ασθενών ως ακραίου βαθμού απλαστική αναιμία. Η εκτιμούμενη συχνότητα εμφάνισης της νόσου είναι 1,3 περιστατικά ανά εκατομμυρίο πληθυσμού το χρόνο και η μέση ηλικία των ασθενών κατά τη διάγνωση είναι τα 35 έτη. Ο μέσος όρος επιβίωσης από τη διάγνωση μετά τις πρόσφατες διαγνωστικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις ανέρχεται σε 25 περίπου χρόνια. Παθογένεια Η σωματική μετάλλαξη του PIGA γονιδίου (phosphatidylinositol glycan complementation group A) έχει ως αποτέλεσμα τη διαταραχή δημιουργίας της άγκυρας γλυκοφωσφατιδυνιλοσιτόλης (GPI-anchor) και ως εκ τούτου τη μερική ή ολική ανεπάρκεια όλων των πρωτεϊνών που φυσιολογικά συνδέονται στην κυτταρική μεμβράνη μέσω της GPI-anchor. Τελική συνέπεια η δημιουργία PNH κλώνων σε όλες τις κυτταρικές σειρές, που το κύριο ανοσοφαινοτυπικό χαρακτηριστικό τους είναι η απουσία όλων των πρωτεϊνών που συνδέονται, μέσω της GPI-anchor στην κυτταρική μεμβράνη (Εικόνα 1). Η έλλειψη των μορίων CD55 (decay accelerating factor, αναστέλλει τη δημιουργία και αποσταθεροποιεί την C3 convertase του συμπληρώματος) και CD59 (membrane inhibitor of reactive lysis, προστατεύει την κυτταρική μεμβράνη από την επίθεση του συμπλέγματος MAC) είναι υπεύθυνη για την ευαισθησία του συμπληρώματος στα ερυθρά αιμοσφαίρια που προκαλεί την ενδαγγειακή αιμόλυση και συρρίκνωση του χρόνου ζωής τους στο 10% σε σχέση με τα φυσιολογικά ερυθρά. Εικόνα 1. Ταξινόμηση Η Παγκόσμια εταιρεία μελέτης της PNH (International PNH Interest Group), λαμβάνοντας υπόψη την ποικιλομορφία των κλινικών εκδηλώσεων καθώς και της πιθανής συσχέτισης με διαταραχές του μυελού, έχει προτείνει ένα σύστημα ταξινόμησης που περιλαμβάνει τρεις κύριες κατηγορίες οι οποίες καλύπτουν ολόκληρο το φάσμα παρουσίας της νόσου. Κλασική PNH, η οποία περιλαμβάνει ασθενείς με εκδηλώσεις ενδαγγειακής αιμόλυσης και θρόμβωσης PNH / A.A. ή PNH / MDS, σε ασθενείς με αιμόλυση και παράλληλη παρουσία άλλων πρωτογενών διαταραχών, όπως απλαστική αναιμία ή μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο Υποκλινική PNH, στην οποία οι ασθενείς έχουν μικρούς κλώνους PNH χωρίς κλινικοεργαστηριακή ένδειξη αιμόλυσης ή θρόμβωσης. Κριτήρια - κλινικές ενδείξεις για την πραγματοποίηση εξέτασης για PNH Η σπανιότητα της νόσου δεν καθιστά απαραίτητη την πραγματοποίηση της εξέτασης σε κάθε ασθενή με αναιμία ή θρόμβωση, ωστόσο η παρουσία και άλλων κλινικών ενδείξεων αυξάνουν την πιθανότητα παρουσίας PNH κλώνων που απαιτούν διερεύνηση. Αν και η πλειοψηφία των PNH ασθενών δεν παρουσιάζει αιμοσφαιρινουρία, κάθε ασθενής με ανεξήγητη αιμοσφαιρινουρία θα πρέπει να υπόκειται σε εξέταση για PNH. Επίσης, σε περιπτώσεις αιμόλυσης, κρίνεται απαραίτητη η εξέταση σε ασθενείς με Coombs-αρνητική αιμολυτική αναιμία, κυρίως δε όταν απουσιάζουν χαρακτηριστικές κυτταρικές ανωμαλίες όπως σφαιροκύτταρα, δρεπανοκύτταρα, σχιστοκύτταρα, και όταν δεν υπάρχει προφανής λοιμώδη αιτία της αιμόλυσης. Η θρόμβωση είναι μια συχνή επιπλοκή της PNH αν και είναι πιο πιθανό να λάβει χώρα σε πιο ασυνήθιστες ανατομικές περιοχές όπως προαναφέρθηκε, γεγονός που είτε από μόνο του, είτε με συνυπάρχουσα ενδαγγειακή αιμόλυση ή κυτταροπενία, συνιστά απαραίτητη την υποβολή σε εξέταση PNH. Η εξέταση δεν είναι αναγκαία σε συμπτώματα όπως κοιλιακό άλγος ή δυσφαγία εκτός αν συνοδεύονται από προηγούμενες χαρακτηριστικές κλινικές ενδείξεις. Στην περίπτωση ασθενών με ΜΔΣ ή απλαστική αναιμία, ανθεκτική κυτταροπενία αγνώστου αιτιολογίας η διερεύνηση για εντοπισμό PNH κλώνων είναι απαραίτητη με χρήση πρωτοκόλλων υψηλής ευαισθησίας. Οι ασθενείς με διαγνωσμένη PNH πρέπει να υποβάλλονται σε ετήσιο επανέλεγχο όταν η νόσος ακολουθεί σταθερή κλινική πορεία, ενώ συχνότερη συνιστάται η υποβολή σε επανέλεγχο σε αυτούς που παρουσιάζουν αλλαγές στις κλινικές ή αιματολογικές τους παραμέτρους (Πίνακας 1). Πίνακας 1. Κριτήρια - κλινικές ενδείξεις για την πραγματοποίηση εξέτασης για PNH Διάγνωση με ΚΡ Η κυτταρομετρία ροής θεωρείται η πλέον κατάλληλη και έγκυρη μέθοδος διάγνωσης της PNH, βασιζόμενη στην ανίχνευση της απουσίας δύο τουλάχιστον GPI-linked πρωτεϊνών στα ερυθρά και στα ουδετερόφιλα, ενώ η μελέτη των μονοκυττάρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως επιπλέον επαληθευτικό δεδομένο. Ωστόσο η διερεύνηση των ουδετερόφιλων παρέχει την ακριβέστερη πληροφορία ως προς το μέγεθος του PNH κλώνου, καθώς η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά παραμένει ανεπηρέαστη σε περιπτώσεις μετάγγισης ή πιθανού αιμολυτικού επεισοδίου, αλλά και συνήθως υπάρχει σε αφθονία σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές. o Χειρισμός του δείγματος Προτιμώμενο υλικό για την κυτταρομετρία είναι περιφερικό αίμα σε EDTA αντιπηκτικό, ενώ και η ηπαρίνη ή ACD είναι αποδεκτά. Η μεταφορά του δείγματος δεν αποτελεί μείζον ζήτημα στην ανίχνευση των PNH κυττάρων, ενώ η κυτταρομετρική ανάλυση συνιστάται να πραγματοποιηθεί το συντομότερο δυνατό και μέσα στα πλαίσια του 24ώρου από τη στιγμή της δειγματοληψίας. Στον Πίνακα 2 αναφέρονται αναλυτικά οι οδηγίες επεξεργασίας του προς ανάλυση δείγματος. Πίνακας 2. o Πρωτόκολλο για RBC Για τη διερεύνηση PNH κλώνων στα ερυθροκύτταρα χρησιμοποιούμε το γνωστό panel δεικτών CD235a, CD55 και CD59. Η οριοθέτηση των RBCs γίνεται με βάση τις FS/SS ιδιότητές τους σε λογαριθμική κλίμακα, σε συνδυασμό με την έκφραση του δείκτη CD235a (Glycophorin A). Έπειτα προσδιορίζεται η επι της εκατό (%) αναλογία των ερυθροκυττάρων των οποίων απουσιάζει ή όχι η έκφραση των δεικτών CD55 και CD59 και οι διαφορές έντασης φθορισμού μπορεί να διακρίνει τους τρεις τύπους PNH ερυθροκυττάρων (Εικόνα 2). Σημαντικό βήμα στην προετοιμασία του δείγματος είναι η σωστή αναλογία κυττάρων/αντισωμάτων (προτεινόμενη αναλογία κατασκευαστή) και η διπλή πλύση του για την αποφυγή συσσωμάτων και μη ειδικής δέσμευσης των αντισωμάτων. Εικόνα 2. o Πρωτόκολλο για WBC (ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα) Στη μελέτη των WBC η στρατηγική οριοθέτησης βασίζεται στις FS/SS ιδιότητες και στην έκφραση χαρακτηριστικών δεικτών τους (CD15, CD45 για τα ουδετερόφιλα και CD14, CD64 για τα μονοκύτταρα). Στη συνέχεια υπολογίζεται η επί της εκατό (%) αναλογία κυττάρων στα οποία απουσιάζει την έκφραση δεικτών που ανήκουν στην ομάδα GPI-A πρωτεϊνών (βλ. Πίνακας 3). Η πιο πρόσφατη προσθήκη στην φαρέτρα των αντισωμάτων και η πλέον αποτελεσματική για τη διάγνωση της PNH στα WBCs είναι το FLAER (Fluorescently labeled inactive toxin aerolysin), όπου η απουσία έκφρασης του στα ουδετερόφιλα και στα μονοκύτταρα καθιστά ικανή την τεκμηρίωση διάγνωσης της νόσου (Εικόνα 3). Πίνακας 3. Εικόνα 3. Προτεινόμενα panel αντισωμάτων και απαντητικό Βιβλιογραφία 1. Borowitz MJ, Craig FE, DiGiuseppe JA, Illingworth AJ, Rosse W, Sutherland DR, Wittwer CT, Richards SJ. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. Cytometry Part B 2010; 78B: 211–230 2. Richards SJ, Whitby L, Cullen MJ, Dickinson AJ, Granger V, Reilly JT, Hillmen P, Barnett D. Development and evaluation of a stabilized whole-blood preparation as a process control material for screening of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria by flow cytometry. Cytometry B 2008;76B:47–55 3. Sutherland DR, Kuek N, Davidson J, Barth D, Chang H, Yeo E, Bamford S, Chin-Yee I, Keeney M. Diagnosing PNH with FLAER and multiparameter flow cytometry. Cytometry B 2007; 72B:167–177. 4. Richards SJ, Hill A, Hillmen P. Recent advances in the diagnosis, monitoring, and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cytometry B 2007; 72B:291–298 5. Richards SJ, Rawstron AC, Hillmen P. Application of flow cytometry to the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cytometry 2000; 42:223–233. 6. Δημητρακοπούλου Λ. Παροξυσμική Νυκτερινή Αιμοσφαιρινουρία (PNH). Βιβλίο Πρακτικών, 6ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κυτταρομετρίας με Διεθνή Συμμετοχή, Κεφαλονιά 2010, σελ. 79-85. Τ και ΝΚ Λεμφοϋπερπλαστικά Νοσήματα και Υπολλειμματική Νόσος Αθανασιάδου Ιωάννα, Βιοχημικός (Msc), Τμήμα Ανοσολογίας και ΙστοσυμβατότηταςΓΝΑ “Λαϊκό” Τ – Λεμφώματα Τα Τ – λεμφώματα είναι μία ομάδα νοσημάτων που προκύπτει από την κλωνική επέκταση ενός μη δεσμευμένου (thymic) ή μη δεσμευμένου (post – thymic) Τ – λεμφοκυττάρου. Η κατάταξη των Τ – λεμφωμάτων κατά WHO το 2008 έγινε με βάση τα διαφορετικά μορφολογικά, ανοσοφαινοτυπικά, μοριακά και κυτταρογενετικά χαρακτηριστικά του κάθε νοσήματος. Πίνακας 1) EXTRANODALU LEUKEMICATURE T-CELL LEUKEMIAS T-cell Prolymphocytic Leukemia (T-PLL) Extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type T-cell Large Granular Lymphocytic Leukemia (TLGL) Enteropathy – associated T-cell lymphoma (EATL) Chronic Lymphoproliferative disorders Aggressive NK-cell Leukemia Adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL)NODAL PERIPHERAL T-CELL LYMPHOMAS NODAL Peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified (PTCL-NOS) Angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) Hepatosplenic T-cell lymphoma (HSTL) Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma (αβ only) (SPTCL)CUTANEOUS T-CELL LYMPHOMA CUTANEOUS Mycosis Fungoides (MF) Sezary Syndrome (SS) Primary Cutaneous CD30+ T-cell lymphoproliferative disease Primary Cutaneous Peripheral T-cell Lymphoma Anaplastic large cell lymphoma (ALCL) ALK+ Anaplastic large cell lymphoma (ALCL) ALKEXTRANODAL PERIPHERAL T-CELL Πίνακας 1 WHO Classification 2008 των Τ και ΝΚ λεμφωμάτων Παράγοντες κινδύνου για τα παραπάνω λεμφώματα μπορεί να είναι είτε ανοσολογικοί παράγοντες (ανοσοανεπάρκειες, ανοσοκαταστολή, αυτοάνοσα νοσήματα) είτε μολύνσεις από μικροοργανισμούς (EBV, HTLV), γενετική προδιάθεση, τρόπος ζωής, χημικά κ.α Στον δυτικό κόσμο αποτελούν το 5-10% συνολικά των λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων ενώ στην Ασία το ποσοστό αυτό αυξάνεται και φτάνει 15-20%. Τα Τ και ΝΚ λεμφώματα πλήττουν κυρίως νέους ανθρώπους και προκαλούν υψηλή θνησιμότητα. Σε αντίθεση λοιπόν με τα B-NHL που είναι πλήρως κατανοητά και ταυτοποιούνται πλήρως από τα περισσότερα εργαστήρια κυτταρομετρίας, τα Τ και ΝΚ λεμφώματα δεν τυποποιούνται με τόση λεπτομέρεια παρ'όλη τη σοβαρότητα της νόσου αλλά και τον ουσιαστικό ρόλο που μπορεί να παίξει ο ανοσοφαινότυπος στην έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση αυτών των λεμφωμάτων. Ο ρόλος του ανοσοφαινοτύπου στη διάγνωση των Τ και ΝΚ λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων Ο χαρακτηριστικός ανοσοφαινότυπος του παθολογικού κυττάρου μπορεί να προκύπτει με διάφορους τρόπους: Μη φυσιολογική έκφραση αντιγόνων Υπερέκφραση Υποέκφραση Απουσία έκφρασης Εκτοπη έκφραση αντιγόνων Εκφραση ειδικού αντιγόνου π.χ CD10 στο AITL Ο χαρακτηριστικός ανοσοφαινότυπος των Τ και ΝΚ λεμφωμάτων αποτελεί σημαντικό “όπλο” στη διάγνωση αυτών των νοσημάτων για τον κλινικό. Η πολυχρωματική ανάλυση έχει την ικανότητα να ανιχνεύει μικρούς παθολογικούς πληθυσμούς κατά τη διάγνωση πριν ακόμη υπάρξει μορφολογική αλλοίωση αλλά και κατά την αναζήτηση υπολειμματικής νόσου. Επίσης είναι ταχύτερη σε σχέση με τις μοριακές τεχνικές για την αναγνώριση κλωνικών αναδιατάξεων. Λαμβάνοντας τα παραπάνω υπόψη, καθώς επίσης και την επιθετικότητα των νοσημάτων, είναι πολύ σημαντικό ο ανοσοφαινότυπος να καθιερωθεί ως μέθοδος διάγνωσης αυτών των νοσημάτων και να εξασφαλίσουμε ότι δε διαφεύγουν παθολογικά δείγματα από το κάθε εργαστήριο κυτταρομετρίας. Στην ομιλία μου θα αναφερθώ σε συγκεκριμένα νοσήματα, προσπαθώντας να καλύψω και τις τέσσερις ομάδες σύμφωνα με τη WHO κατάταξη. Αγγειονοσοβλαστικό Λέμφωμα (AILT) Το αγγειονοσοβλαστικό λέμφωμα (AILT) ανήκει στην κατηγορία των λεμφικών (nodal) περιφερικών Τ-λεμφωμάτων. Αποτελεί το 15-20% των Τ-λεμφωμάτων, εμφανίζεται στην ηλικία των 60 και είναι υψηλής θνησιμότητας αφού ο μέσος χρόνος ζωής είναι 1-3 έτη. Παρουσιάζεται με γενικευμένη λεμφαδενοπάθεια, ηπατοσπληνομεγαλία, Β-συμπτώματα και δερματικές αλλοιώσεις. Εργαστηριακά ευρήματα αποτελούν η υπεργαμμασφαιριναιμία, αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία και ηωσινοφιλία ενώ ιστολογικά παρατηρούνται μικρά λεμφοκύτταρα, ιστιοκύτταρα, ηωσινόφιλα και πλασματοκύτταρα. Η διάγνωση του βασίζεται στην ιστολογική εξέταση, στον χαρακτηριστικό ανοσοφαινότυπο και στη μοριακή μελέτη για Τ-κλωνικότητα. Ο ανοσοφαινότυπος του AITL χαρακτηρίζεται από την συνέκφραση του CD10 με Τ-κυτταρικούς δείκτες και την απώλεια ενός ή περισσοτέρων Τ-δεικτών. Συγκεκριμένα το αγγειονοσοβλαστικό λέμφωμα προκύπτει από ένα ώριμο CD4+ κύτταρο το οποίο είναι: CD2+ CD4+ CD5+ CD8- CD56CD3+dim ή CD3CD7- ή CD7+ CD10+ Large Granular Lymphocyte Disorders (LGL) Αυτές οι παθήσεις ανήκουν στην ομάδα των ώριμων Τ-κυτταρικών λευχαιμιών σύμφωνα με τη WHO 2008 κατάταξη. Αποτελούν ένα φάσμα παθήσεων το οποίο προκύπτει είτε από την κλωνική επέκταση ενός Τ-λεμφοκυττάρου οπότε και προκύπτει η T-cell Large Granular Lymphocytic Leukemia (T-LGL) ή από ΝΚ κύτταρο οπότε έχουμε είτε Chronic Lymphoproliferative Disorders of NK είτε πιο επιθετική μορφή Aggressive NK-cell Leukemia. Οι παθήσεις των LGL κυττάρων μπορεί να είναι παροδικές επεκτάσεις (<6 μήνες) και να οφείλονται σε αυτοάνοσα νοσήματα, λοιμώξεις κ.α οπότε σε αυτή την περίπτωση είναι πολυκλωνικές. Σε περίπτωση που επιμένουν πάνω από 6 μήνες είναι συνήθως κλωνικές και απαντώνται μετά από αλλογενή μεταμόσχευση του μυελού των οστών ή μετά από θεραπεία με Mabthera. H T-LGL λευχαιμία αποτελεί το 2-5% των Τ και ΝΚ κυτταρικών κακοηθειών συνολικά. Πρέπει να υπάρχει εμμένουσα αύξηση των LGL κυττάρων στο περιφερικό αίμα για διάστημα άνω των 6 μηνών. Πλήττει άνδρες και γυναίκες με τον ίδιο ρυθμό με μέση ηλικία εμφάνισης τα 60 έτη. Παρουσιάζεται με ουδετεροπενία ενώ το 1/3 των ασθενών παραμένουν ασυμπτωματικοί. Είναι νόσημα καλής πρόγνωσης αφού έχει μέση επιβίωση >10 έτη. 'Ηπιο νόσημα, σχετικά καλής πρόγνωσης είναι και τα χρόνια λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα των ΝΚ. Αντίθετα η “επιθετική” ΝΚ λευχαιμία, όπως προκύπτει και από την ονομασία της, είναι ένα νόσημα με επιθετική μορφή, με μέση ηλικία εμφάνισης τα 39 έτη η οποία συνδέeται με την EBV λοίμωξη. Οι ασθενείς παρουσιάζουν λεμφαδενοπάθεια, λεμφοκυττάρωση, ηπατοσπληνομεγαλία και θρομβοπενία. Για τη διάγνωση των LGL παθήσεων συνεκτιμώνται αν υπάρχει λεμφοκυττάρωση (2-20 x109/L), κυκλοφορούντα LGL κύτταρα (< 0,5x109/L),κλινική κατάσταση, τεκμηρίωση κλωνικότητας Τ κυτταρικού πληθυσμού με PCR και χαρακτηριστικός ανοσοφαινότυπος. Ανοσοφαινότυπος T-LGL Λευχαιμίας CD2+ CD3+ CD8+ CD16+ CD57+ CD5- CD7CD56+ σπανίως συνδέεται με πιο επιθετική μορφή της νόσου Σπανίως CD4+ / CD8- ή CD8dim CD4- / CD8Ανοσοφαινότυπος NK – Λευχαιμίας CD3- CD16+ CD56+ Εκτός από τους παραπάνω χαρακτηριστικούς ανοσοφαινοτύπους η κυτταρομετρία θα μπορούσε να μπορούσε να συμβάλλει στην τεκμηρίωση Τ κλωνικότητας με TCR Vb Repertoire kit καθώς επίσης και με τη μελέτη KIR υποδοχέων για την κλωνικότητα των ΝΚ κυττάρων. Σύνδρομο Sezary – Σπογγοειδής Μυκητίαση Το σύνδρομο Sezary και η σπογγοειδής μυκητίαση ανήκουν στην κατηγορία των Τ-δερματικών λεμφωμάτων. Τα Τ-δερματικά λεμφώματα είναι ένα ετερογενές γκρουπ από λεμφοϋπερπλαστικές διαταραχές οι οποίες προκαλούνται από κλωνικά Τ κύτταρα που εισβάλλουν στο δέρμα. Η σπογγοειδής μυκητίαση είναι το πιο καλά μελετημένο Τ-δερματικό λέμφωμα και αποτελεί το 1% όλων των Non-Hodgkin λεμφωμάτων. Προσβάλλει με διπλάσιο ρυθμό άνδρες από ότι γυναίκες με μέση ηλικία εμφάνισης τα 57 έτη. Το σύνδρομο Sezary είναι η λευχαιμική μορφή της σπογγοειδούς μυκητίασης κατά το οποίο ο ασθενής έχει γενικευμένη ερυθροδερμία και χαρακτηριστικά λεμφοκύτταρα στο περιφερικό αίμα τα οποία ονομάζονται κύτταρα Sezary. Για τη διάγνωση του συνδρόμου Sezary η βιοψία δέρματος είναι σημαντική καθώς και η κλινική εξέταση αλλά και η μέτρηση αυτών των άτυπων Τ-λεμφοκυττάρων, των κυττάρων Sezary. Στη μέτρηση αυτών των κυττάρων σημαντικό ρόλο παίζει η πολυχρωματική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής αφού αυτά τα κύτταρα έχουν χαρακτηριστικό ανοσοφαινότυπο. Κύτταρα Sezary CD4+ CD7- CD26T cell clonality Η μοριακή μελέτη χρησιμοποιείται για να επιβεβαιώσει την ύπαρξη κλωνικών αναδιατάξεων στα TCR γονίδια ενώ δεν υπάρχει συγκεκριμένο pattern χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Αναπλαστικό Τ – λέμφωμα (ALCL) Το αναπλαστικό Τ-λέμφωμα αποτελείται ουσιαστικά από 3 διαφορετικές οντότητες οι οποίες διαφοροποιούνται σύμφωνα με μοριακά και κλινικά κριτήρια και συγκεκριμένα από την έκφραση της κυτταροκίνης (CD30) και την έκφραση της κινάσης αναπλαστικού λεμφώματος προκαλείται από τη χρωμοσωμική μετάθεση t(2;5). (ALK), η οποία Συγκεκριμένα υπάρχει το ALK+ ALCL, το οποίο χαρακτηρίζεται από την έκφραση της ALK, προσβάλλει νεαρούς άνδρες και είναι καλής πρόγνωσης. Αντίθετα το ALK- ALCL δεν εκφράζει την ALK, προσβάλλει άνδρες και γυναίκες μέσης ηλικίας και είναι κακής πρόγνωσης. Τέλος το δερματικό ALCL έχει τελείως διαφορετικά κλινικά χαρακτηριστικά, εμφανίζεται de novo στο δέρμα με μέση ηλικία εμφάνισης τα 60 έτη. Ο ανοσοφαινότυπος και αυτού του λεμφώματος είναι χαρακτηριστικός με την έκφραση του CD30. Το 90% των αναπλαστικών λεμφωμάτων έχουν Τ-κυτταρικό ανοσοφαινότυπο με έκφραση του CD3+ και κλωνικές αναδιατάξεις των TCR γονιδίων. Το 10% των αναπλαστικών λεμφωμάτων έχει ΝΚκυτταρικό φαινότυπο με απουσία έκφρασης του CD3- και έκφραση του CD56+. Τέλος υπάρχουν και κάποιες αρκετά σπάνιες περιπτώσεις αναπλαστικού λεμφώματος με Β-κυτταρικό ανοσοφαινότυπο. Ηπατοσπληνικό Τ – λέμφωμα Το ηπατοσπληνικό γδ Τ – λέμφωμα είναι μια ξεχωριστή οντότητα Τ-λεμφώματος. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις ηπατοσπληνικού αβ Τ-λεμφώματος και πιστεύεται ότι είναι ανοσοφαινοτυπική ποικιλομορφία του ίδιου νοσήματος. Παραμένει άγνωστη η διαγνωστική αξία αυτής της ανοσοφαινοτυπικής ποικιλομορφίας αβ ή γδ. Το ηπατοσπληνικό λέμφωμα εμφανίζεται με ηπατοσπληνομεγαλία και κυτταροπενία αλλά χωρίς λεμφαδενοπάθεια. Το συγκεκριμένο λέμφωμα έχει κυτταροτοξικό ανοσοφαινότυπο που συνδέεται με κυτταρογενετική ανωμαλία στο χρωμόσωμα 7q. Ο ανοσοφαινότυπος του ηπατοσπληνικού γδ λεμφώματος είναι: CD2+ CD3+ TCRγδ+ CD56+ CD16+ CD7+ ή CD7CD5- CD4- CD8- TCRαβΗ εμπειρία ενός κέντρου Όπως προκύπτει από τα παραπάνω ο ανοσοφαινότυπος παίζει σημαντικό ρόλο στη διάγνωση των παραπάνω Τ – λεμφωμάτων. Ένα αξιόπιστο εργαστήριο κυτταρομετρίας θα πρέπει να διασφαλίζει ότι έχει τον απαραίτητο εξοπλισμό π.χ σύγχρονα όργανα που επιτρέπουν την πολυχρωματική ανάλυση με τουλάχιστον 4 φθοριοχρώματα και πάνω καθώς και το καταρτισμένο προσωπικό που θα έχει τη γνώση και την εμπειρία να ερμηνεύσει σωστά την έκφραση ή απουσία έκφρασης συγκεκριμένων δεικτών. Τα παραπάνω είναι απαραίτητα για να αποφεύγεται η αποτυχία διάγνωσης σε τόσο επιθετικά λεμφώματα και να χάνεται πολύτιμος χρόνος και ίσως και ζωές. Πολλές φορές παρόλο που δουλεύονται όλοι οι σωστοί δείκτες ο τρόπος ανάλυσης είναι λανθασμένος και οδηγεί σε λάθος συμπεράσματα. Πιο συγκεκριμένα: 1. Αναλύουμε το σύνολο των κυττάρων και δεν αναλύουμε μόνο την περιοχή των λεμφοκυττάρων. 2. Χρησιμοποιούμε όσο το δυνατόν μπορούμε όλους τους ειδικούς δείκτες για την τυποποίηση ενός λεμφώματος. 3. Αξιολογούμε όλους τους δείκτες. Από τα παραπάνω προκύπτει ένα τεράστιο πάνελ εξειδικευμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων τα οποία όλο και λιγότερα εργαστήρια θα έχουν την πολυτέλεια να εφαρμόζουν. Για την σωστή διαγνωστική προσέγγιση αλλά και την εξοικονόμηση πόρων ξεκινούμε με ένα πάνελ βασικών Τ, Β και ΝΚ δεικτών καθώς και κάποιων μονοκυτταρικών και μυελικών δεικτών, προχωρούμε στην ανάλυση όλων των κυττάρων και έπειτα προσθέτουμε στρατηγικά επιπλέον δείκτες για την τυποποίηση τυχόν παθολογικού πληθυσμού. Βιβλιογραφία 1)Matutes E. British Haematology, Touch Briefing (2010):65-69 2)Merchant S. et al Am.J. Clin.Pathol. 2006;126:29-38 3)Chen W. et.al. Cytometry Part B 2006; 70B:142-148 4)Sokol L. et.al. The Oncologist 2006;11:263–273 5)Rodriguez-Abreu D.et.al. Hematol Oncol 2008; 26: 8–20 6)Olsen E. et. al. BLOOD, 2007;110:1713-1720 7)Kim Y et al BLOOD, 2007;110: 479-484 8)Osuji N. et.al. CANCER 2006;107:570-578 9)Vose J.M et.al. Journal of Clinical Oncology, 2008;4124-4130 Β ΛΕΜΦΟΫΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΙΚΗ ΝΟΣΟΣ Ε. Κώνστα Χημικός, PhD, Επιστημονικός Συνεργάτης, Β’ Παθολογική Προπαιδευτική Κλινική, Αιματολογική Μονάδα, Π.Γ.Ν. «Αττικόν» Τα Β λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα οντοτήτων -όπως αυτό περιγράφεται στην Ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας- οι οποίες εμφανίζουν κλινική ή/και εργαστηριακή αλληλοεπικάλυψη, με αποτέλεσμα να υπάρχει δυσκολία ως προς την επακριβή τους κατάταξη. Πέραν της ιστολογικής διάγνωσης και κατάταξης των νοσημάτων αυτών, μετά από βιοψία του πάσχοντος ιστού ή οργάνου, σημαντικό ρόλο στη διάγνωση και διαφορική τους διάγνωση παίζει και η μορφολογία των κυττάρων, όπως αυτά αναγνωρίζονται από τον αιματολόγο στο επίχρισμα του αίματος, μυελού των οστών, παρακέντησης λεμφαδένων κ.λ.π. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των Β λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων είναι η παρουσία νόσου στο αίμα με διαφορετική για κάθε νόσημα συχνότητα και με ποικίλο αριθμό παθολογικών κυττάρων. Η μορφολογία των κυττάρων αυτών είναι συνήθως χαρακτηριστική του νοσήματος, χωρίς όμως η ταυτοποίησή τους να είναι δυνατή άνευ της συμβολής της κυτταρομετρίας ροής και φυσικά και άλλων μεθόδων. Στα Β λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα είναι επίσης σημαντική η γνώση της συχνότητας προσβολής του μυελού των οστών, καθώς και ο τύπος κατανομής της διήθησης. Η εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής στη μελέτη των ασθενών με Β λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα έχει τους ακόλουθους στόχους: συμβολή στη διάγνωση, διαφορική διάγνωση και κατάταξή τους, παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία, τεκμηρίωση της πλήρους υφέσεως με ανίχνευση της ελαχίστης υπολειμματικής νόσου, καθώς και πιστοποίηση πρώιμης υποτροπής της νόσου. Τέλος σε λίγες περιπτώσεις η κυτταρομετρία ροής συμβάλλει και στην πρόγνωση των νοσημάτων αυτών. Τα δείγματα, τα οποία μελετώνται, αφορούν αίμα, μυελό των οστών, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, πλευριτικό και ασκιτικό υγρό, εναιώρημα παρακέντησης λεμφαδένων κ.λ.π. Είναι γνωστό ότι με την κυτταρομετρία ροής υπάρχει δυνατότητα μελέτης μεγάλου αριθμού κυττάρων, ανάλυσης μεγάλου αριθμού δειγμάτων και κυρίως αναζήτησης έκφρασης περισσότερων του ενός αντιγόνων στα ίδια κύτταρα και επομένως ακριβέστερη ταυτοποίηση του νοσήματος. Όμως, υπάρχει δυσχέρεια άμεσης συσχέτισης του ανοσοφαινότυπου των κυττάρων με τη μορφολογία τους. Μία ομάδα ειδικών κατέληξε το 2006 στη Bethesda σε συγκεκριμένες κατευθυντήριες οδηγίες χρήσης της κυτταρομετρίας ροής με βάση το είδος των αιμοποιητικών σειρών και το σύνολο των αντιγόνων που θα πρέπει να ελεγχθούν σε κάθε αιματολογικό νεοπλασματικό νόσημα. Επίσης, περιέγραψε μία σειρά κλινικών ενδείξεων και συμπτωμάτων μιας πιθανούς λεμφοειδούς νεοπλασίας: παγκυτταροπενία, λεμφοκυττάρωση, ηωσινοφιλία, άτυπα κύτταρα σε βιολογικά υγρά, οργανομεγαλία ή συμπαγείς όγκοι, πλασματοκυττάρωση και μονοκλωνική γαμμαπάθεια. Αναιμία, λευκοπενία, μονοκυτταροπενία και παγκυτταροπενία μπορεί να συνοδεύουν δευτερογενώς τη νόσο. Επιπρόσθετα, μία πολύ πρόσφατη μελέτη των Béné και συν. [7] συνοψίζει τις κατευθυντήριες οδηγίες χρήσης της κυτταρομετρίας ροής για το διαγνωστικό χειρισμό των Β λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων. Τα νεοπλασματικά Β-ώριμα λεμφοκύτταρα διακρίνονται από τα φυσιολογικά κύτταρα με δύο κυρίως φαινοτυπικά χαρακτηριστικά: 1. Έκφραση μίας τάξης (κ ή λ) της ελαφριάς αλυσίδας ανοσοσφαιρίνης υπάρχει μόνο στην περίπτωση νεοπλασματικών Β-ώριμων λεμφοκυττάρων (μη φυσιολογική αναλογία κ/λ), η οποία όμως σε περίπτωση μικρών παθολογικών πληθυσμών δεν μπορεί να διακριθεί εύκολα. Επίσης, πρέπει να ληφθεί υπόψιν η μη ειδική χρώση, κάτι το οποίο μπορεί να παρακαμφθεί με αρχική οριοθέτηση των CD19+ ή CD20+ Β κυττάρων. 2. Έκφραση αντιγόνων που δεν υπάρχουν σε φυσιολογικά Β κύτταρα, π.χ.CD13 ή CD33, CD5. Πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχουν μικροί πληθυσμοί φυσιολογικών CD5+ Β κυττάρων τόσο στο περιφερικό αίμα όσο και στον μυελό των οστών (αιματογόνια), γι’ αυτό και η θετική έκφραση του CD5 των Β κυττάρων θα πρέπει να συσχετισθεί με διαφοροποιημένη ένταση χρώσης των CD20, CD22 και CD79b. Η ύπαρξη μικρών πληθυσμών φαινοτυπικά μη φυσιολογικών Β κυττάρων στην περίπτωση ασθενών με ιστορικό Β λεμφοϋπερπλαστικού νοσήματος, ιδιαίτερα εάν ο φαινότυπος είναι όμοιος με αυτό της αρχικής διάγνωσης, είναι ιδιαίτερα σημαντική. Αντίθετα, στην περίπτωση ασθενών που δεν έχουν κάποιο ιστορικό λεμφικής κακοήθειας, μη φυσιολογικά Β κύτταρα σε ποσοστό μικρότερο του 5% από το σύνολο των μετρούμενων κυττάρων δεν πρέπει να χρησιμοποιηθούν για την τυποποίηση μιας κακοήθειας - ιδιαίτερα σε ασθενείς μεγαλύτερης ηλικίας. Διακρίνονται τέσσερις διαφορετικές ομάδες νεοπλασιών με Β-ώριμα λεμφοκύτταρα με βάση την έκφραση των CD5 και CD10 (Πίνακας 1): Πίνακας 1: Κυτταρομετρική προσέγγιση στην κατάταξη των Β λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων. Α) Στην CD5+/CD10- ομάδα ανήκει η Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ), η προλεμφοκυτταρική λευχαιμία (PLL), το λέμφωμα του μανδύα (MCL) και λιγότερο συχνά το λέμφωμα οριακής ζώνης (MZL), το διάχυτο λέμφωμα από μεγάλα Β κύτταρα (DLBCL) και το λεμφοπλασματοκυτταρικό λέμφωμα (LPL). Θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι ένα μέρος φυσιολογικών Β κυττάρων είναι CD5 θετικό. Οι περισσότερες ΧΛΛ έχουν τον χαρακτηριστικό φαινότυπο: CD23+, FMC-7- και ασθενής έκφραση CD20, CD22, CD79b και επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης (sIg). Οι άτυπες μορφές ΧΛΛ απαιτούν διαφορετική προσέγγιση και καθιστούν δύσκολη τη διάκριση από τις άλλες CD5+ Β νεοπλασίες, ευκολότερη στις περιπτώσεις DLBCL και PLL (μορφολογική διάκριση) και δυσκολότερη σε περιπτώσεις MCL (υπερέκφραση κυκλίνης-D1 ή διαμετάθεση t(11;14)q(13;q32) που οδηγεί σε αναδιάταξη του γονιδίου CCND1) και σε CD5+ MZL (CD23-, μορφολογική εκτίμηση, ανοσοϊστοχημεία με καλοήθη οζώδη βλαστικά κέντρα, κλωνική πλασματοκυτταρική διαφοροποίηση, η οποία συναντάται και σε LPL και σε ΧΛΛ). Η ανεύρεση γενετικών ανωμαλιών, όπως (11;18)(q21;q21), t(1;14)(p22;q32), t(14;18)(q32;q21) προσανατολίζουν σε εξωλεμφαδενικό MZL ή σπληνικό MZL (MALT1 γονίδιο, έλλειψη 7q31). Επίσης, 5% των LPL εμφανίζουν CD5+ και η επιβεβαίωση κυτταροπλασματικής της διάγνωσης ελαφράς αλυσίδας, απαιτεί πλασματοκυτταρική αποκλεισμό MCL κλωνικότητα κυτταρογενετικά ή ανοσοϊστοχημικά και εκτίμηση της εντόπισης της νόσου (η LPL κυριαρχεί σε περιφερικό αίμα και μυελό των οστών). Ένα ποσοστό των DLBCL, που είναι CD5+, είτε πρόκειται για ΧΛΛ με μεγάλα κύτταρα είτε για βλαστική παραλλαγή MCL είτε είναι ενδαγγειακό Β λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα είτε πρόκειται για μορφή de novo (με ιδιαίτερες γενετικές ανωμαλίες και χειρότερη πρόγνωση). Το προλεμφοκυτταρικό λέμφωμα μπορεί να προκύψει από μετατροπή ΧΛΛ (αύξηση CD20, sIg, μειωμένο CD5) και φαίνεται πανομοιότυπο με ΧΛΛ. Η PLL μπορεί να διακριθεί μορφολογικά και λόγω μεγάλης λευκοκυττάρωσης, ηπατομεγαλίας και σπληνομεγαλίας, αν και πρέπει να διακριθεί από τη βλαστική μορφή MCL. Β) Στην CD5-/CD10+ ομάδα ανήκουν κατά σειρά συχνότητας τα DLBCL, FL (οζώδες λέμφωμα) και BL (λέμφωμα Burkitt), ενώ 10% των περιστατικών τριχωτής λευχαιμίας είναι CD10+. Ωστόσο, υπάρχουν αναφορές και σε CD10+ LPL, MZL και MCL. Όταν ανιχνεύεται CD10+ ώριμο Β κύτταρο με κυτταρομετρία ροής, η εκτίμηση προς FL ή DLBCL γίνεται μορφολογικά. Η πιο βοηθητική μέθοδος διάκρισης έχει αναφερθεί ότι είναι το CD71 (FL-low intensity, DLBCL και BL-high intensity). Η διάκριση του BL γίνεται φαινοτυπικά (CD10+, CD5-, bcl-2-, CD43+, sIg+, Tdt-, CD34-) και ενισχύεται γονοτυπικά (αναδιατάξεις c-MYC), αν και υπάρχει DLBCL CD10+, bcl-2-, bcl-2+ μορφή BL, ΟΛΛ με sIg και c-MYC+ DLBCL. Η διάκριση BL και DLBCL γίνεται μορφολογικά (ομοιογενής πληθυσμός με ενδιάμεσου μεγέθους κύτταρα, βασεόφιλα, με κενοτόπια, πυρήνια και ετερογενής με μεγάλα κύτταρα, αντίστοιχα), κυτταρομετρικά (υψηλός δείκτης πολλαπλασιασμού Ki-67 και χαμηλός, αντίστοιχα) και γονοτυπικά (μεμονωμένη αναδιάταξη c-MYC και αναδιατάξεις c-MYC, bcl-2, bcl-6, αντίστοιχα). Οι c-MYC και bcl-2 αναδιατάξεις σχετίζονται με φτωχή πρόγνωση. Όσον αφορά την τριχωτή λευχαιμία (HCL), CD10+ και CD10- μορφή είναι μορφολογικά και κλινικά όμοιες και θεραπεύονται με τον ίδιο τρόπο. Ο φαινότυπος CD20+, CD22+, sIg+, CD38-, FMC-7+ και ιδιαίτερα η ύπαρξη CD11c+, CD25+, CD103+ επισφραγίζει τη διάγνωση τριχωτής λευχαιμίας. Γ) Στην CD5+/CD10+ ομάδα ανήκουν τα DLBCL και FL, αν και είναι ασυνήθιστα. Η διάκριση γίνεται μορφολογικά (FL, μικρά κύτταρα και DLBCL, μεγάλα κύτταρα), ενώ η γονοτυπική ταυτοποίηση είναι επιτακτική. Η έκφραση CD43 και bcl-2 συμβάλλει στη διαφοροδιάγνωση (FL, CD43-, bcl-2+, ενώ DLBCL, ποικιλία έκφρασης CD43, bcl-2). Δ) Η ομάδα CD5-/CD10- ομάδα εμφανίζει ετερογένεια και περιλαμβάνει: DLBCL, MZL, HCL, LPL, CD10-FL, CD5-MCL. Όσον αφορά την HCL, ο φαινότυπος CD20++, CD22++, CD11c++, CD25+, CD103+, sIg+, FMC-7+, CD23-, CD5-, CD10- εμφανίζει μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα στη διάγνωση, από ότι η ανθεκτική στο τρυγικό όξινη φωσφατάση (TRAP). Συχνές είναι οι παρεκκλίσεις από αυτό το φαινότυπο, οπότε και είναι πιθανή η έλλειψη CD103, CD25 ή CD23. Ωστόσο, η HCL variant (HCLv), όπου υπάρχει υψηλότερη λευκοκυττάρωση (απουσία μονοκυτταροπενίας), υπάρχουν ευδιάκριτα πυρήνια και είναι TRAP και CD25 αρνητική, πρέπει να διαφοροδιαγιγνώσκεται από την κλασσική HCL και από σπληνικό MZL. Το MZL εμφανίζει χαρακτηριστική μορφολογία, η οποία ανιχνεύεται ευκολότερα σε λεμφαδενικό ιστό από ότι σε μυελό και περιφερικό αίμα και είναι συχνά CD11c+ ή CD103+, ενώ δεν υπάρχει ο συνδυασμός CD103+, CD11c+ και CD22+ και η ανίχνευση της έλλειψης 7q31 προσανατολίζει σε σπληνικό MZL. Όσον αφορά το LPL, στο 60-80% των ασθενών εμφανίζεται ο φαινότυπος CD5-, CD10- CD23-. Δύσκολη είναι η διάκρισή του από το MZL, αλλά διακρίνεται από την HCL με το φαινότυπο CD103-. Επίσης, η αναγνώριση των CD10-FL και CD5-MCL απαιτεί συνδυασμό μορφολογικών, ανοσοφαινοτυπικών και γονοτυπικών κριτηρίων, ενώ η ύπαρξη CLL/SLL CD5- είναι σπάνια. Με βάση τις κατευθυντήριες οδηγίες χρήσης της κυτταρομετρίας ροής για το διαγνωστικό χειρισμό των Β λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων [7], η συνεισφορά του ανοσοφαινότυπου έγκειται στη χρήση πληθώρα δεικτών (μεταξύ αυτών θα πρέπει να συμπεριληφθούν και οι CD38, κ και λ), αφού γίνει αρχικά οριοθέτηση των CD19+ B λεμφοκυττάρων (Πίνακας 2). Δεδομένου της σημερινής οικονομικής κατάστασης (τόσο διεθνώς όσο και στην Ελλαδα), ίσως να πρέπει να παραλειφθούν ορισμένοι από τους αναφερόμενους δείκτες και να χρησιμοποιούνται μόνο αυτοί του Πίνακα 2 (συμπεριλαμβανομένων και των CD38, κ και λ). Μία συζήτηση για αυτό το θέμα είναι απαραίτητη. Ο συνδυασμός CD19/CD10/CD38 μπορεί να αποδειχθεί ιδιαίτερα χρήσιμος στην ταυτοποίηση των αιματογονίων σε δείγματα μυελού των οστών, ενώ σε συνδυασμό με το δείκτη CD138 και την ασθενή έκφραση CD19 και θετική έκφραση CD38 μπορει να γίνει η ανίχνευση των πλασματοκυττάρων. Επιπρόσθετα, η μελέτη αυτή υποδεικνύει τη χρήση και άλλων δεικτών: CD200, cyclin D1, CD123, CD81 για τον πληρέστερο ανοσοφαινοτυπικό χαρακτηρισμό των Β λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων, ενώ γίνεται λόγος για το ενδοκυττάριο Bcl2, το οποίο σε συνδυασμό με τους δείκτες CD38 και ZAP70 προσφέρει πρόσθετη προγνωστική αξία. Το CD38 και το ZAP-70 έχουν ιδιαίτερη προγνωστική αξία σε CLL/SLL με την έκφραση του CD38 ως ανεξάρτητου δείκτη φτωχής πρόγνωσης και το ZAP-70 ως τον καλύτερο προγνωστικό δείκτη σε ασθενείς με αμετάλλακτο το γονίδιο της μεταβλητής περιοχής της βαρειάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (IgVH). Πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχουν πολλές τεχνικές δυσκολίες στην αξιολόγηση της έκφρασης του ZAP-70 (ασθενής χρώση, ενδοκυττάρια έκφραση, μη ειδική χρώση, μείωση έντασης με την πάροδο του χρόνου, αδυναμία ορισμού του θετικού πληθυσμού). Πίνακας 2: Συνεισφορά του ανοσοφαινότυπου στη διάγνωση Β λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων. Πρέπει να σημειωθεί ότι ο ανοσοφαινότυπος των παθολογικών κυττάρων δεν αποτελεί αφ’εαυτού απόλυτο κριτήριο του προσδιορισμού διάγνωσης ενός Β λεμφοϋπερπλαστικού νοσήματος, γιατί ενδέχεται τα κύτταρα δύο διαφορετικών νοσημάτων να εκφράζουν τους ίδιους βασικούς ανοσοφαινοτυπικούς δείκτες. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο το εργαστήριο κυτταρομετρίας ροής να έχει ενημερωθεί με κλινικοεργαστηριακές πληροφορίες του ασθενούς, ενώ ο αιματολόγος να αξιολογήσει την απάντηση του φαινοτύπου σε σύγκριση με τα υπόλοιπα δεδομένα του ασθενούς. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΕΛΑΧΙΣΤΗΣ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ Η πιθανή εκρίζωση της νόσου με τις νεότερες θεραπείες και η συσχέτιση με μεγαλύτερη επιβίωση, δημιούργησε την ανάγκη σχετικά πρόσφατα για την ανίχνευση ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (ΕΥΝ). Η κυτταρομετρία ροής φαίνεται να ανταποκρίνεται με επιτυχία στο δεδομένο στόχο, συμφωνεί γενικά με τις τεχνικές PCR, είναι ταχύτερη και φθηνότερη. Η ευαισθησία της τοποθετείται σε επίπεδο 10-4. Η Β χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (Β-ΧΛΛ) πρόσφατα έγινε πεδίο κυτταρομετρικής εφαρμογής ΕΥΝ με εκτεταμένο κλινικό ενδιαφέρον. Άλλα λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα, που εφαρμόζεται η κυτταρομετρία ροής στην ΕΥΝ, είναι η λευχαιμία από τριχωτά κύτταρα και τα Β μη Hodgkin λεμφώματα. Οι στρατηγικές που βασίζονταν στην μελέτη των Β λεμφοκυττάρων με έκφραση CD5 δεν φαίνεται να είναι ικανοποιητικές, εφόσον πολλά από τα CD5+ Β λεμφοκύτταρα κατά την ύφεση της νόσου είναι αντιδραστικά και πολυκλωνικά. Η πολυχρωματική κυτταρομετρία έδωσε τη δυνατότητα καλύτερης στρατηγικής με περιορισμένο αριθμό τετραπλών ή πενταπλών συνδυασμών, με στόχο τη διάκριση μεταξύ των Β κυττάρων του νοσήματος και των φυσιολογικών. Ειδικότερα όταν εξετάζεται μυελικό εναιώρημα υφίσταται πρόβλημα διάκρισης και από τα αιματογόνια. Πρόσφατα δημοσιεύτηκαν τα πρώτα αποτελέσματα της τυποποιημένης προσέγγισης διεθνούς συνεργατικής μελέτης με βάση την στρατηγική που αρχικά προτάθηκε και αξιολογήθηκε από τον Rawstron και συν. [8]. Η ποσοτικοποίηση γίνεται με βάση τα μετρικά γεγονότα του ολικού Β στοιχείου, όπως εκτιμάται με το CD19 ως προς τα γεγονότα των λευκών με το CD45. Το άθροισμα της ΕΥΝ ανιχνεύεται με βάση τις διαφορετικές εκφράσεις συνδυασμών που περιέχουν τα CD5/CD19, CD20/CD38, CD79b/CD43. Ο ρόλος της κλωνικότητας με τον λόγο κ/λ αναφέρεται ότι χρησιμοποιείται, αλλά έρχεται σε δεύτερη προτεραιότητα. Η μελέτη του αίματος φάνηκε πρακτικά ισοδύναμη με εκείνη του μυελικού εναιωρήματος, με εξαίρεση την περίπτωση ελέγχου ανταπόκρισης στην πρόσφατη θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα CD52 ή CD20. Τα μετρικά γεγονότα του αθροίσματος της ΕΥΝ που απαιτούνται είναι 20-50 και απαιτούν μέτρηση 5x105 μετρικών γεγονότων ολικών κυττάρων (~5 λεπτά ανά συνδυασμό και 15-20 λεπτά περίπου ανά δείγμα). Τα πιθανά μειονεκτήματα της στατηγικής αφορούν Β-ΧΛΛ με άτυπο φαινότυπο (έντονο CD20 και CD79b, ασθενές CD23 και CD43). Στην περίπτωση αυτή ο φαινότυπος της διάγνωσης μπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη εξειδικευμένης στρατηγικής. Η λευχαιμία από τριχωτά κύτταρα έχει υψηλή ολική επιβίωση στα 10 χρόνια (70-90%). Με το ερώτημα αν είναι εφικτή η εκρίζωση της νόσου, όπως και στην Β-ΧΛΛ, η οποία πιθανόν να έχει σχέση μειωμένη πιθανότητα υποτροπής της νόσου και θεραπεία με μονοκλωνικό αντι CD20, χρησιμοποιείται κυτταρομετρία ροής για την ανίχνευση ΕΥΝ. Κατά τη διαμόρφωση της στρατηγικής ενδιαφέρον εύρημα αποτελεί η ανεύρεση σε φυσιολογικούς μάρτυρες (δείγμα: μυελός των οστών) Β υποπληθυσμού με έντονη έκφραση CD11c και CD22. Αντίθετα, η χρήση του ειδικότερου αντιγόνου CD103 φαίνεται πιο κατάλληλη με «φυσιολογικό» επίπεδο 10-4, το οποίο είναι και το όριο ευαισθησίας. Η εκρίζωση της νόσου στο επίπεδο αυτό διαπιστώθηκε σε 12 από 13 ασθενείς με θεραπευτική αγωγή Cladribin και Rituximab [10]. Η ομάδα Catovsky μελέτησε μη Hodgkin Β λεμφώματα (B-NHL) και Β-ΧΛΛ με κυτταρομετρία ροής και οστεομυελική βιοψία [11]. Ενώ στην Β-ΧΛΛ, η κυτταρομετρία ροής έδειξε μεγαλύτερη ευαισθησία από την οστεομυελική βιοψία, στα B-NHL συνέβη το αντίθετο. Στο 13% των θετικών οστεομυελικών βιοψιών δεν ανιχνεύθηκε νόσος με κυτταρομετρία ροής. Η ερμηνεία που δόθηκε αφορά πιθανή πτωχή αποκόλληση των λεμφωματικών κυττάρων με παραδοκιδώδη διήθηση. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι ερευνητές χρησιμοποίησαν απλή διχρωμία. Άλλη συγκριτική μελέτη Duggan και συν. [12], με τριχρωμία έδειξε ότι η κυτταρομετρία ροής είχε μεγαλύτερη ευαισθησία από την μορφολογία στις περιπτώσεις με μικρή διήθηση. Συμπερασματικά, ο αιματολόγος δεν πρέπει να θεωρεί προς το παρόν ισοδύναμη τη δοκιμασία ανίχνευσης ΕΥΝ με κυτταρομετρία ροής με αυτή της οστεομυελικής βιοψίας στα B-NHL, μέχρι να διευκρινιστεί αν επιδρά ο τρόπος δειγματοληψίας ή το είδος της στρατηγικής. Υπάρχουν διάφοροι περιορισμοί κατά τον προσδιορισμό ανίχνευσης ΕΥΝ με κυτταρομετρία ροής: 1. Τα λευχαιμικά κύτταρα δεν είναι μόνο γενετικά ασταθή, αλλά και ανοσοφαινοτυπικά. 2. Υπάρχουν μερικές φορές σπάνια «φυσιολογικά» κύτταρα ή άτυπα κύτταρα «αδιευκρίνιστης σημασίας», τα οποία βρίσκονται σε πολύ μικρό ποσοστό στο δείγμα, τα οποία μπορεί να «μοιάζουν» με τα νεοπλασματικά και δεν είναι εύκολη η διάκριση αυτών. 3. Ο αναγεννώμενος μυελός μετά από θεραπευτική απλασία ή υπό τη δράση αυξητικών παραγόντων αποτελεί καλύτερο δείγμα από το μυελό σε ηρεμία, εάν χρειάζεται να αξιολογηθεί η ΕΥΝ με μία δεδομένη στρατηγική, η οποία εφαρμόζεται κατά τη διάρκεια της θεραπείας. 4. Ο έλεγχος ανίχνευσης ΕΥΝ αφορά κατά κανόνα ένα μέρος μόνο και όχι το σύνολο των νεοπλασματικών κυττάρων, όταν ακολουθείται μία δεδομένη στρατηγική. Επίσης, πρέπει να λαμβάνεται υπ’όψιν και η ένταση με την οποία εκφράζονται τα αντιγόνα. 5. Αν και η αύξηση της συνδυαστικής ικανότητας (πολλαπλοί συνδυασμοί ανοσοφθορισμών στο ίδιο κύτταρο) της σύγχρονης κυτταρομετρίας ροής αποτέλεσε σημαντικό πλεονέκτημα στην ανίχνευση ΕΥΝ, εν τούτοις η φασματική επικάλυψη των φθοριζουσών ουσιών μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικά ή ψευδώς αρνητικά ευρήματα. 6. Σήματα μη ειδικού φθορισμού που προέρχονται από artifacts (ηλεκτρονικό θόρυβο, debris, αποπτωτικά/νεκρά κύτταρα, αιμοπετάλια) μπορεί να προκαλέσουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα, τα οποία μπορεί να ξεπεραστούν με προσθήκη αντιγόνων που «ελέγχουν» την παρεμβολή (π.χ. CD3 για τα Τ λεμφοκύτταρα). 7. Η ανίχνευση ΕΥΝ δεν ισοδυναμεί αυτόματα και με την πρόβλεψη του δυναμικού ανάκαμψης της νόσου. 8. Οι σχεδιασμοί στρατηγικής ανίχνευσης ΕΥΝ είναι συνήθως «ευρηματικοί» και δεν προκύπτουν από ενδελεχή μελέτη και κατανόηση των φυσιολογικών κυττάρων, δηλαδή η στρατηγική «κατασκευάζεται» πάνω στα δεδομένα της αρχικής διάγνωσης και προορίζεται για τον συγκεκριμένο ασθενή. Επομένως δεν μπορεί να εφαρμοστεί από άλλο κέντρο το οποίο δεν έχει τα στοιχεία αυτά. Πρέπει σε κάθε περίπτωση να γίνει κατανοητό από το Εργαστήριο Κυτταρομετρίας Ροής ότι η ανάπτυξη στρατηγικών ΕΥΝ με κυτταρομετρία ροής προϋποθέτει συχνή εφαρμογή, με οργανωμένο τρόπο και στα πλαίσια πάντα ελεγχόμενων κλινικοεργαστηριακών μελετών. Η τυχαία «μεταγραφή» πρωτοκόλλων ελέγχου ΕΥΝ της βιβλιογραφίας σε σποραδικές περιπτώσεις πρέπει να αποφεύγεται. Οι στρατηγικές ανίχνευσης ΕΥΝ με κυτταρομετρία ροής δεν είναι ένα στατικό αλλά ένα δυναμικό πεδίο, το οποίο συνεχώς μεταβάλλεται και τροποποιείται ανάλογα με την εμπειρία που συγκεντρώνεται και την εξέλιξη της τεχνολογίας. Τέλος, η αξιολόγηση μιας στρατηγικής ανίχνευσης ΕΥΝ με κυτταρομετρία ροής δεν είναι εύκολη, καθότι δεν υπάρχει μέθοδος αναφοράς, ούτε πρέπει να θεωρούνται οι μοριακές τεχνικές ως μέθοδοι αναφοράς. Συνεπώς, δεν συνιστάται η τυχαία μεταπήδηση από τη μία τεχνική στην άλλη. Η δυνατότητα διαδικτυακής μεταφοράς των ψηφιακών αρχείων κυτταρομετρικής ανάλυσης ΕΥΝ με κυτταρομετρία ροής από περιφερικά εργαστήρια σε ένα κέντρο αναφοράς, δίνει τη δυνατότητα εκτεταμένης εφαρμογής μιας στρατηγικής χωρίς να είναι απαραίτητη η εφαρμογή της στον τόπο που παρασκευάζονται και αναλύονται τα δείγματα των ασθενών. ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΗ Β ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΣΗ (ΜΒΛ) Με βάση τη νέα κατά WHO 2008 ταξινόμηση, ο απόλυτος αριθμός των μονοκλωνικών Β λεμφοκυττάρων στην ΜΒΛ πρέπει να είναι κάτω από 5000/κκχ. Τα κριτήρια της κλωνικότητας με βάση το λόγο κ/λ είναι 0,3<κ/λ<3. Αν ο φαινότυπος είναι συμβατός π.χ. με Β-ΧΛΛ και ο αριθμός χαμηλός, πρέπει να αποκλειστούν μια σειρά από πιθανότητες, πριν μπει η διάγνωση ΜΒΛ. Η αντικειμενική εξέταση πρέπει να είναι αρνητική, χωρίς λεμφαδένες ή οργανομεγαλία και ο απεικονιστικός έλεγχος να μην αποκαλύψει παρόμοια ευρήματα. Το Β λεμφοκυτταρικό λέμφωμα από μικρά λεμφοκύτταρα (B-SLL), μπορεί να έχει εικόνα στο αίμα παρόμοια με ΜΒΛ. Επίσης, δεν πρέπει να υπάρχουν κλινικές ενδείξεις Β συμπτωματολογίας λεμφώματος (πυρετό, απώλεια βάρους), ούτε στοιχεία αυτοάνοσου νοσήματος (π.χ. αυτοάνοση αιμολυτική αναιμία) με Β κλώνο. Ομοίως και για τις λοιμώξεις. Εφόσον αποκλειστούν οι παραπάνω πιθανότητες τότε υπάρχει ΜΒΛ με φαινότυπο είτε τυπικής ή άτυπης Β-ΧΛΛ ή μη Β-ΧΛΛ τύπου. Στις περιπτώσεις ΜΒΛ με φαινότυπο μη Β-ΧΛΛ τύπου, τα δεδομένα είναι ακόμη ελάχιστα. Στη ΜΒΛ με φαινότυπο Β-ΧΛΛ, τα στοιχεία προέρχονται από περιορισμένο αριθμό μελετών και δεν μπορούν να εφαρμοστούν ακόμη στην κλινική πράξη. Όπως αναφέρθηκε, ο απόλυτος αριθμός του CD5+ κλώνου είναι ο πιο τεκμηριωμένος προγνωστικός παράγοντας εξέλιξης. Ο συνήθης φαινότυπος ΜΒΛ και Β-ΧΛΛ εμφανίζεται πανομοιότυπος. Μικρές μελέτες αναφέρονται στα αντιγόνα CD38, CD49d και ZAP70 χωρίς να υπάρχει ομοφωνία. Η πρόσφατη μελέτη των Rossi και συν. [13] είναι σημαντική γιατί εξετάζει συγχρόνως κλινικές, αιματολογικές, βιοχημικές, μοριακές, κυτταρογενετικές και ανοσοφαινοτυπικές παραμέτρους. Φαίνεται ότι οι κλασικοί προγνωστικοί παράγοντες έχουν προγνωστική σημασία και στη ΜΒΛ, όπως και στη Β-ΧΛΛ. Έτσι, οι μη μεταλλαγμένες ΜΒΛ εξελίσσονται συχνότερα σε νόσο Β-ΧΛΛ, όπως επίσης συμβαίνει και στις κυτταρογενετικά άτυπες περιπτώσεις ΜΒΛ με +12, ΑΤΜ και p53. Όσον αφορά τον ανοσοφαινότυπο ΜΒΛ, ποσοστά έκφρασης των αντιγόνων CD38 και CD49d μεγαλύτερα από 30% εμφανίζονται να έχουν στατιστικά σημαντικά δυσμενή προγνωστική αξία. Επίσης, στη μελέτη των Rossi και συν. [13] φαίνεται ότι η ΜΒΛ έχει σαφώς μικρότερη διήθηση στο μυελό από τη Β-ΧΛΛ, στην οποία αυξάνεται με την πρόοδο των σταδίων. Εντούτοις, πρέπει να τονιστεί ότι σε αρκετές περιπτώσεις, το ποσοστό του κλώνου μπορεί να είναι σχετικά υψηλό (π.χ. 20-30% ή και μεγαλύτερο) και να υπάρχει στασιμότητα των ευρημάτων χωρίς κλινική εξέλιξη προς Β-ΧΛΛ. Πολύ πρόσφατη μελέτη των Shanafelt και συν. [14] συνοψίζει κατευθυντήριες οδηγίες για το διαγνωστικό χειρισμό και την παρακολούθηση της ΜΒΛ. Με βάση αυτές, η κυτταρομετρία ροής σε εναιώρημα μυελού δεν φαίνεται να είναι απαραίτητη σε περιπτώσεις με τυπικό φαινότυπο Β-ΧΛΛ στο μέτρο που σχετικά υψηλές διηθήσεις φάνηκαν να παραμένουν διαχρονικά σταθερές χωρίς εξέλιξη προς νόσο. Αντίθετα, σε ΜΒΛ με άτυπο Β-ΧΛΛ φαινότυπο και μη Β-ΧΛΛ φαινότυπο, συνιστάται έλεγχος με κυτταρομετρία ροής του μυελού και οστεομυελική βιοψία. Το ιστορικό και η φυσική εξέταση είναι απαραίτητα. Οι απεικονιστικές μέθοδοι συνιστάται να γίνουν μόνο αν ο φαινότυπος είναι άτυπος. Κατά την παρακολούθηση των ασθενών αυτών, η εκτίμηση του απόλυτου αριθμού του κλώνου με κυτταρομετρία ροής μέχρι στιγμής δεν θεωρείται απαραίτητη, εφόσον δεν υπάρχουν ενδείξεις από τη γενική αίματος για απόλυτη αύξηση λεμφοκυττάρων. Συνιστάται η γενική αίματος να γίνεται ανά έτος (στις άτυπες περιπτώσεις ο έλεγχος είναι συχνότερος), όπως επίσης και κλινική εξέταση με την ίδια συχνότητα. Όμως υπάρχει το ερώτημα εάν ο αριθμός των κυττάρων έχει σημασία στην περίπτωση της ΜΒΛ και εάν το όριο των 5000/κχχ είναι πλασματικό και όχι πραγματικό, με βιολογική διακριτική σημασία μεταξύ Β-ΧΛΛ και ΜΒΛ. Η μελέτη των Rawstron και συν. [15] καθώς και αυτή των Rossi και συν. [13] συνδέει αναμφίβολα το απόλυτο φορτίο του κλώνου με την εξέλιξη από ΜΒΛ σε Β-ΧΛΛ. Αριθμός Β κλωνικών κυττάρων πάνω από 3700/κχχ σαφώς σημαίνει πέντε φορές μεγαλύτερη πιθανότητα εξέλιξης σε Β-ΧΛΛ σε σχέση με αριθμό κάτω από 1200/κχχ. Ειδικά πάνω από 3700/κχχ CD5+ Β μονοκλωνικά λεμφοκύτταρα, σχετίζονται με εξέλιξη προς Β-ΧΛΛ στο 75% των ατόμων σε λιγότερο από 3 χρόνια. Από την άλλη πλευρά όμως, το όριο των 5000/κχχ φαίνεται να έχει βιολογική σημασία και να διαχωρίζει την ΜΒΛ από την Β-ΧΛΛ σε στάδιο Rai 0, που εμφανίζονται με διαφορετική βιολογική συμπεριφορά. Συμπερασματικά, ο ανοσοφαινότυπος και η κυτταρομετρία ροής αποτελούν βασικά στοιχεία του διαγνωστικού ελέγχου της ΜΒΛ, αλλά και της παρακολούθησης της οντότητας αυτής, η οποία πλέον υπεισέρχεται με αυξημένη συχνότητα στη διαφοροδιάγνωση των Β λευμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων. Βιβλιογραφία: 1. Πάγκαλης Γ.Α., Κυρτσώνη Χ., Βασιλακόπουλος Θ.Π., Σαχανάς Σ., Γιακουμή Ξ., Καλπαδάκη Χ., Μοσχογιάννη Μ., Δημητρακοπούλου Α., Αγγελοπούλου Μ.Κ., Κοντοπίδου Φ.Ν., Ανοσοφαινοτυπική μελέτη Β-χρόνιων λεμφοϋπερπλαστικών νόσων από την πλευρά του κλινικού, Βιβλίο Πρακτικών 6ου Πανελληνίου Συνεδρίου Κυτταρομετρίας, 16-22 (2010). 2. Stetler-Stevenson M., Davis B., Wood B., Braylan R., 2006 Bethesda International Consensus Conference on Flow Cytometry Immunophenotyping of Hematolymphoid Neoplasia, Cytometry B Clin Cytom, 72B, S3 (2007). 3. Wood B., Arroz M., Barnett D., et al., 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia by flow cytometry: optimal reagents and reporting for the flow cytometric diagnosis of hematopoietic neoplasia, Cytometry B Clin Cytom, 72B, S14-S22 (2007). 4. Τσαγκαράκης Ν., Πατεράκης Γ., Η αξία της κυτταρομετρικής μελέτης του ανοσοφαινότυπου του μυελού των οστών και του περιφερικού αίματος στη διαχείριση αιματολογικών νοσημάτων, Haema, 11(1-2), 17-35 (2008). 5. Craig F.E., Foon K.A., Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms, Blood prepublished online Jan 15, doi: 10.1182/blood-2007-11-120535 (2008). 6. Clinical and laboratory Standards Institute. Clinical Flow Cytometric Analysis of Neoplastic Hematolymphoid Cells; Approved Guideline, 2nd ed. CLSI document H43-A2, Vol.27, No. 11. Wayne, PA: Clinical and laboratory Standards Institute, p.45-46 (2007). 7. Béné M.C., Nebe T., Bettelheim P., Buldini B., Bumbea H., Kern W., Lacombe F., Lemez P., Marinov I., Matutes E., Maynadié M., Oelschlagel U., Orfao A., Schabath R., Solenthaler M., Tschurtschenthaler G., Vladareanu A.M., Zini G., Faure G.C., Porwit A., Immunophenotyping of acute leukaemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10, Leukemia, 25, 567-574 (2011). 8. Rawstron A.C., Villamor N., Ritgen M., Böttcher S., Ghia P., Zehnder J.L., Lozanski G., Colomer D., Moreno C., Geuna M., Evans P.A.S., Natkunam Y., Coutre S.E., Avery E.D., Rassenti L.Z., Kipps T.J., Caligaris-Cappio F., Kneba M., Byrd J.C., Hallek M.J., Montserrat E., Hillmen P., International standardized approach for flow cytometric residual disease monitoring in chronic lymphocytic leukaemia, Leukemia, 1-9 (2007). 9. 10. Πατεράκης Γ., Κυτταρομετρικές μέθοδοι ανίχνευσης, Haema, 456-465 (2007). Ravandi F., Jorgensen J., O’Brien S., Verstovsek S., Koller C., Faderl S. et al., Eradication of minimal residual disease in hairy cell leukaemia, Blood, 107, 4658-4662 (2006). 11. Sah S.P., Matutes E., Watherspoon A.C., Morilla R., Catovsky D., A comparison of flow cytometry, bone marrow biopsy, and bone marrow aspirates in the detection of lymphoid infiltration in B cell disorders, Journal of Clinical Pathology, 56, 129-132 (2003). 12. Duggan P.R., Easton D., Luider J., Auer I.A., Bone marrow staging of patients with non-Hodgkin lymphoma by flow cytometry: correlation with morphology, Cancer, 15, 894-899 (2000). 13. Rossi D., Sozzi E., Puma A., De Paoli L., Rasi S., Spina V. et al., The prognosis of clinical monoclonal B cell lymphocytosis differs from prognosis of Rai 0 chronic lymphocytic leukaemia and is recapitulated by biological risk factors, Br J Haematol, 146, 64-75 (2009). 14. Shanafelt T.D., Ghia P., Lanasa M.C., Landgren O., Rawstron A.C., Monoclonal B lymphocytosis (MBL): Biology, natural history and clinical management, Leukemia, doi: 10.1038/leu.2009.287,1-9 (2010). 15. Rawstron A.C., Bennett F.L., O’ Connor S.J., Kwok M., Fenton J.A., Plummer M. et al., Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia, N Engl J Med, 359, 575583 (2008). 16. Πατεράκης Γ., Λεμφοϋπερπλαστικά σύνδρομα-Μονοκλωνική Β λεμφοκυττάρωση, Βιβλίο Πρακτικών 6ου Πανελληνίου Συνεδρίου Κυτταρομετρίας, 86-91 (2010). 17. Monoclonal B-Cell Lymphocytosis: Our Evolving Perspective of a Prevalent Biomarker, Cytometry B Clin Cytom, 78B, S1 (2010). Πιστοποίηση, Διαπίστευση. Πιστοποιητικό εκπαίδευσης στην Κυτταρομετρία Κατερίνα Ψαρρά Η διαπίστευση σύμφωνα με το EN ISO 15189 οδηγεί στην εφαρμογή στοιχείων ενός ολοκληρωμένου συστήματος διαχείρισης ποιότητας στα κλινικά εργαστήρια. Ο γνωστός σε όλους κύκλος της ποιότητας περιλαμβάνει την αλληλεξάρτηση και αλληλεπίδραση μεταξύ της διασφάλισης ποιότητας (quality assurance), της επικύρωσης των μεθόδων (assay validation) και των ρυθμιστικών συμμορφώσεων (regulatory compliance). Διασφάλιση ποιότητας Στην κυτταρομετρία ροής η διασφάλιση ποιότητας περιλαμβάνει: προτύπωση διαδικασιών και πρακτικών, επικύρωση μεθόδων, συντήρηση μηχανημάτων, παρακολούθηση (επίδοση μεθόδων και μηχανημάτων) και φυσικά τη βελτίωση όλων των παραπάνω. Πιο συγκεκριμένα η διασφάλιση ποιότητας, που αφορά τους κυτταρομετρητές ροής, περιλαμβάνει τον καθημερινό, μηνιαίο, ημι-ετήσιο ή ετήσιο έλεγχο της λειτουργίας τους με βάση τα κατάλληλα σφαιρίδια καθώς και την καταγραφή όλων των ανωτέρω ελέγχων. Από την άλλη μεριά η διασφάλιση ποιότητας των μεθόδων περιλαμβάνει την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση των μεθόδων, την επικύρωσή τους, τη χρήση κατάλληλων υλικών για τον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας και φυσικά τη συμμετοχή σε προγράμματα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Η ανάπτυξη και βελτιστοποίηση των μεθόδων αφορά το είδος του δείγματος και την αξιολόγηση των αντισωμάτων και των συνθηκών χρώσης, είναι ωστόσο χρονοβόρα. Υπάρχουν αντίστοιχες προτάσεις στη βιβλιογραφία (πολύ συχνά στο Cytometry). Όλα είναι πολύ πιο απλά όταν η μέθοδος είναι επικυρωμένη από τον κατασκευαστή του kit, όπως η μέτρηση των CD34+ κυττάρων με τα IVD/CE kits των εμπορικών εταιρειών. Τότε αρκεί η επαλήθευση της μεθόδου, κατά την οποία αφού επιβεβαιωθούν οι προδιαγραφές του κατασκευαστή, πρέπει να δοκιμασθεί η μέθοδος σε 25-50 δείγματα, που να καλύπτουν όλη την κλίμακα των αναφερόμενων κλινικών δειγμάτων. Όταν πρόκειται για μεθόδους in-house, όπως η πλειονότητα των κλινικών εφαρμογών της κυτταρομετρίας ροής, η μέθοδος απαιτεί επικύρωση. 100-120 δείγματα πρέπει να χωρισθούν και τα αποτελέσματα να συγκριθούν με αυτά άλλου εργαστηρίου, ή να συγκριθούν με άλλη επικυρωμένη μέθοδο, ή να συγκριθούν με την κλινική διάγνωση. Απαιτείται να δοκιμασθεί λογικός αριθμός δειγμάτων από λογικό αριθμό διαγνωστικών ομάδων (δεν είναι απαραίτητο να καλυφθούν όλες οι οντότητες της WHO – αυτό αποτελεί μάλλον ουτοπία). Ένας πρότυπος τρόπος αντιμετώπισης μιας τέτοιας μεθόδου παρουσιάζεται στην εργασία των AC Rawstron και συν. (2007), όπου παρουσιάζοντας τις κατευθυντήριες οδηγίες για τον προσδιορισμό της MRD στα λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα, προχώρησαν και στην επικύρωση της μεθόδου. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι ειδικές για τις μεθόδους της κυτταρομετρίας παρατηρήσεις των συγγραφέων, που φαίνεται ότι θα πρέπει να λαμβάνονται υπ’ όψη πέραν των καθιερωμένων προσδιορισμών ακρίβειας, πιστότητας, ορίου ανίχνευσης (limit of detection – LOD), που παρουσιάζονται αναλυτικά στις παρουσιάσεις των ομιλητών του στρογγυλού τραπεζιού για τον έλεγχο ποιότητας στο 5ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κυτταρομετρίας στην Ολυμπία. Παρατήρησαν λοιπόν οι συγγραφείς ότι τόσο η αναλυτική ευαισθησία όσο και η αναλυτική ειδικότητα, αλλά και η ακρίβεια του προσδιορισμού εξαρτώνται από τον αριθμό των αποκτηθέντων συμβαμάτων, καθώς και από το αν λαμβάνεται υπ’ όψη το LOD, ή απλά σαν όριο ανίχνευσης λαμβάνεται υπ’ όψη το γνωστό όριο του 0,01%. Όσον αφορά το LOD, εξαρτάται από και αυτό από τον αριθμό των συμβαμάτων, αλλά πρέπει να λαμβάνεται υπ’ όψη και το επίπεδο επιμόλυνσης, που στην συγκεκριμένη περίπτωση προτείνεται να προσδιορίζεται μέσω του αριθμού των ανιχνευομένων CD19+CD3+ συμβαμάτων. Έγινε επίσης προσπάθεια εκτίμησης της ακρίβειας, πιστότητας, ευαισθησίας και ειδικότητας της μεθόδου σε πολυκεντρική μελέτη είτε αφήνοντας ελεύθερους τους συμμετέχοντες να χρησιμοποιήσει ο καθένας τη μέθοδό του είτε μοιράζοντας σε όλους κοινό πρωτόκολλο προετοιμασίας και μέτρησης στον κυτταρομετρητή. Παρατηρήθηκε λοιπόν ότι και οι τέσσερις παράμετροι, που χαρακτηρίζουν τη μέθοδο, βελτιώθηκαν σημαντικά όταν χρησιμοποιήθηκε κοινό πρωτόκολλο. Βλέπουμε εδώ μια ιδιαιτερότητα των κυτταρομετρικών μεθόδων, που οφείλεται βέβαια στη μη ύπαρξη εναρμονισμού μεταξύ των εργαστηρίων, και που πρέπει να λαμβάνεται υπ’ όψη όταν ένα εργαστήριο αποφασίσει να μπει στη διαδικασία της διαπίστευσης. Τα δείγματα, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν, για τον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας είναι κυτταρικά εναιωρήματα ελέγχου, εμπορικά δείγματα ελέγχου από συντηρημένο πλήρες αίμα με γνωστές αναλογίες των ποικίλων κυτταρικών τύπων, αλλά χρησιμοποιούνται και δείγματα φρέσκου πλήρους αίματος, κατεψυγμένα κύτταρα και κυτταρικές σειρές ανάλογα με την εφαρμογή. Υπάρχουν ειδικά δείγματα ελέγχου για DNA ανάλυση, για CD34+ κύτταρα καθώς και δείγματα ελέγχου από σφαιρίδια. Είναι προφανές ότι η αληθινή ακρίβεια των μεθόδων της κυτταρομετρίας, δηλ. η εγγύτητα της συμφωνίας μεταξύ μέσης τιμής και μιας τιμής αναφοράς, δεν είναι δυνατόν ποτέ να βρεθεί. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται τα διεργαστηριακά προγράμματα ποιότητας, όπως αυτά του UK-NEQAS, του CAP και τα εθνικά προγράμματα. Τέλος, όπου αυτά δεν υπάρχουν, μπορούμε να καταφύγουμε σε σύγκριση με άλλο εργαστήριο, σε σύγκριση με μέθοδο αναφοράς (ποια είναι αυτή;) ή σε σύγκριση με την κλινική διάγνωση. Όσον αφορά την πιστότητα, δηλ. τη διασπορά πολλαπλών μετρήσεων, διακρίνεται στην intra-assay, όπου γίνονται πολλαπλές μετρήσεις (πιθανά 5) τριών δειγμάτων, που καλύπτουν ευρεία κλίμακα (χαμηλή, μεσαία, υψηλή συγκέντρωση) και στην inter-assay, όπου αντίστοιχα 3 δείγματα μετρώνται 5 διαφορετικές ημέρες (σταθερότητα δείγματος;). Το αποτέλεσμα αποδίδεται ως τυπική απόκλιση (standard deviation - SD) ή ως % συντελεστής μεταβλητότητας (% coefficient of variation – %CV). Η σταθερότητα του δείγματος είναι μια πολύ σημαντική παράμετρος για την κυτταρομετρία ροής. Αφορά τη σταθερότητα από τη λήψη του δείγματος μέχρι την επεξεργασία του. Είναι γνωστό ότι τώρα διατίθενται στο εμπόριο διαλύματα, που διατηρούν τα δείγματα για μακρύτερο χρονικό διάστημα, έχουν ωστόσο και αυτά συγκεκριμένους περιορισμούς και απαιτούν σχετική μελέτη αν χρησιμοποιηθούν. Αφορά επιπρόσθετα τη σταθερότητα του δείγματος από το πέρας της επεξεργασίας μέχρι τη μέτρηση στον κυτταρομετρητή, και τη χρήση κατάλληλου μονιμοποιητικού υλικού. Αφορά τέλος τη σταθερότητα των αντιδραστηρίων, των παρασκευαζόμενων στο εργαστήριο cocktails μονοκλωνικών αντισωμάτων καθώς και των διαλυμάτων εργασίας. Όλα αυτά είναι απαραίτητο να προσδιορισθούν, να τηρούνται σχολαστικά και να καταγραφεί η διαδικασία για την περίπτωση που δεν είναι δυνατή η τήρησή τους. Ποιο πρωτόκολλο πρέπει να χρησιμοποιούμε σε κάθε περίπτωση; Αν χρησιμοποιήσουμε πρωτόκολλα και διαδικασίες προτεινόμενες στη βιβλιογραφία, όπως η λίστα των αναφορών, που παρατίθενται, με κατευθυντήριες οδηγίες για ποικιλία εφαρμογών, μπορούμε να αποφύγουμε τις διαδικασίες αυτές; Πρόσφατα και μετά από πρόταση του M. Roederer, το περιοδικό Cytometry δημοσιεύει τα λεγόμενα OMIPs (optimized multicolor immunofluorescence panels - βελτιστοποιημένα πολυχρωματικά panels ανοσοφθορισμού), με τους παρακάτω κανόνες: 1. ένα OMIP πρέπει να έχει πέντε ή περισσότερα χρώματα. 2. εξ ορισμού ένα OMIP έχει υποστεί εκτεταμένη βελτιστοποίηση 3. ένα OMIP δεν μπορεί να είναι μια ασήμαντη επέκταση παλαιότερου panel. 4. όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι διαθέσιμα για το κοινό. Έχουν δημοσιευθεί OMIPs για τα α) ανθρώπινα Τ κύτταρα, που απαντούν σε αντιγόνο (OMIP-001), β) τα ειδικά ανθρώπινα CD8 T κύτταρα (OMIP-002), γ) τα αρχέγονα αιμοποιητικά CD34+CD38- κύτταρα σε περιστατικά MDS. Διαπίστευση Θα αναφερθούμε παρακάτω στις ιδιαιτερότητες της Διαπίστευσης όσον αφορά τα κλινικά εργαστήρια κυτταρομετρίας στην Ευρώπη, όπως εφαρμόζεται ή προτείνεται να εφαρμοσθεί. Είναι γνωστό ότι η διαπίστευση διενεργείται από ένα οργανισμό – σώμα διαπίστευσης σε κάθε χώρα, που αποτελεί και το Εθνικό Σώμα Διαπίστευσης (στην Ελλάδα το ΕΣΥΔ), ότι υπάρχουν σε κάθε χώρα εκπαιδευμένοι αξιολογητές (inspectors) και εμπειρογνώμονες και ότι η διαπίστευση των κλινικών εργαστηρίων εν γένει γίνεται κατά ISO 15189. Η διαπίστευση μπορεί να αφορά είτε ολόκληρο τομέα π.χ. ανοσολογία, αιματολογία, είτε να γίνεται ανά δοκιμασία. Οι αξιολογητές υποβάλλονται σε εκπαίδευση ποικίλης διάρκειας ανά χώρα, θα πρέπει όμως να είναι μη προκατειλημμένοι, ανοιχτόμυαλοι, ικανοί να εργάζονται ομαδικά, αλλά και αυτά τα χαρακτηριστικά δεν είναι προαπαιτούμενα σε κάθε χώρα, υπάρχουν δηλ. χώρες όπου έχει σημασία μόνο η τεχνική επάρκεια. Υπάρχουν κατευθυντήριες οδηγίες για την εκπαίδευση των αξιολογητών, αλλά κύρια η εκπαίδευση γίνεται κατά την εργασία (on the job). Οι αξιολογητές πρέπει να είναι ιατροί ή επιστήμονες υγείας με αντίστοιχη εκπαίδευση, αλλά όσον αφορά τα εργαστήρια κυτταρομετρίας θα πρέπει να συμπεριλαμβάνονται εμπειρογνώμονες εξειδικευμένοι στην κυτταρομετρία (και αυτό αμφισβητείται). Συζήτηση πολλή γίνεται για το αν πρέπει να επιτρέπεται η προσέγγιση ανά δοκιμασία ή θα πρέπει να υποβάλλεται σε διαπίστευση ένας ολόκληρος τομέας συνολικά. Αποδεικνύεται η ικανότητα παροχής ιατρικών διαγνωστικών υπηρεσιών. Με τον όρο διαγνωστική υπηρεσία ορίζεται κάτι πολύ ευρύτερο από την εκτέλεση μιας αναλυτικής διαδικασίας (συμπεριλαμβάνεται η συμβουλευτική για την επιλογή μιας δοκιμασίας, οι προαναλυτικές παράμετροι, η δειγματοληψία, η εκτέλεση, η αναφορά και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων). Ακολουθεί ο συνδυασμός και το πρότυπο – υπόδειγμα του συνδυασμού των δοκιμασιών. Πολλή συζήτηση γίνεται επίσης για τα αποτελέσματα που προτρέπουν στην εκτέλεση άλλων δοκιμασιών. Θα πρέπει επίσης να θεωρηθεί ότι ορισμένες δοκιμασίες αποτελούν ομάδα και πιθανά η επικύρωση της μιας να αποτελεί επικύρωση και των υπολοίπων, περίπτωση πολύ συχνή στην περίπτωση των κυτταρομετρικών κλινικών εφαρμογών. Ένα σημαντικό ερώτημα είναι αν ενδείκνυται η χρήση λίστας ελέγχου (checklist). Η λίστα είναι χρήσιμη κατά την προετοιμασία για διαπίστευση και κατά την αυτο-αξιολόγηση. Επίσης βοηθάει διότι ουσιαστικά προτείνει τις κατευθυντήριες οδηγίες, όπως στην περίπτωση της διαπίστευσης από την EFI (European Federation of Immunogenetics). Όμως η λίστα ελέγχου δεν επιτρέπει την ευελιξία, πρέπει να ανασκοπείται και να προσαρμόζεται τακτικά και να συνοδεύεται από τη δήλωση, ότι φυσικά δεν ελέγχονται τα πάντα παρά μόνο επιλεκτικά και ότι σε επόμενο έλεγχο αν διαπιστωθεί νέα μη συμμόρφωση δεν ευσταθεί ο ισχυρισμός, ότι δεν είχε διαπιστωθεί αρχικά. Και φυσικά εξαιρετικά σημαντικό είναι στο πιστοποιητικό διαπίστευσης να διευκρινίζονται, να δηλώνονται και να καθίστανται διαθέσιμες για το κοινό οι συγκεκριμένες διαδικασίες, που συμμετέχουν στο διαπιστευμένο πεδίο του Τμήματος. Εκπαίδευση στην κυτταρομετρία και τεκμηρίωση της εκπαίδευσης Κατά τη διαδικασία της διαπίστευσης τίθεται μεταξύ άλλων το ερώτημα: Τα άτομα, που έχουν επιφορτισθεί με τις τεχνικές διαδικασίες στην κυτταρομετρία ροής, έχουν υποβληθεί στην κατάλληλη εκπαίδευση και διαθέτουν τουλάχιστον ένα χρόνο εμπειρία υπό την επίβλεψη κατάλληλα εκπαιδευμένου υπευθύνου; (ένα από τα ερωτήματα της λίστας ελέγχου). Γενικότερα ποιος εκπαιδεύει στην κυτταρομετρία και ποιος πιστοποιεί την επάρκεια της εκπαίδευσης αυτής; Πηγές εκπαίδευσης στην κυτταρομετρία αποτελούν: επίσημη θεωρητική εκπαίδευση, που προσφέρουν οι κατασκευαστές των μηχανημάτων, εκπαίδευση κατά την εργασία (on the job), διαδικτυακή και αυτοεκπαίδευση, συνεχιζόμενη εκπαίδευση από σεμινάρια και συνέδρια (ενημέρωση για εξελίξεις). Στις κατευθυντήριες οδηγίες της Bethesda έχουν προταθεί τα εξής επίπεδα υπευθυνότητας που απαντώνται στα κλινικά εργαστήρια κυτταρομετρίας ροής: χειριστής κυτταρομετρητή, προχωρημένος χειριστής (αναλυτής), εκπαιδευτής, ερμηνευτής αποτελεσμάτων. Προτείνεται ότι η εκπαίδευση πρέπει να περιλαμβάνει τη θεωρία και τις εφαρμογές της κλινικής κυτταρομετρίας, την επιλογή δειγμάτων και το σχεδιασμό panels, τον έλεγχο ποιότητας μηχανημάτων και αντιδραστηρίων, το χειρισμό των μηχανημάτων και την απόκτηση των δεδομένων, την ανάλυση από πρωτογενή αρχεία (list mode analysis), την ερμηνεία και αναφορά των αποτελεσμάτων. Η σημαντική διαφορά μεταξύ των επιπέδων εκπαίδευσης και αντίστοιχα υπευθυνότητας έγκειται στην εμπειρία σε χρόνο αλλά κύρια σε αριθμό και ποικιλία περιστατικών. Πώς θα μπορούσε να πιστοποιηθεί αυτή η ικανότητα; Με επίσημες θεωρητικές εξετάσεις, με εξετάσεις ικανότητας σε πρωτογενή δεδομένα (ανάλυση list mode), με λίστες ελέγχου, με εξετάσεις διαδικτυακά (on line), που αφορούν και την επανεκτίμηση. Ήδη η ISAC (International Society for Advancement of Cytometry) σε συνεργασία με την ICCS (International Clinical Cytometry Society) προτείνει το certification Cytometry (υπάρχουν πληροφορίες στo διαδικτυακό τόπο της ISAC). Λόγω αρκετών διαφορών με το αμερικανικό σύστημα εκπαίδευσης στην Ευρώπη οι εθνικές επιστημονικές εταιρείες ή και κεντρικά το ESCCA (European Society of Clinical Cell Analysis) θα μπορούσαν να αναλάβουν αυτό το έργο με βάση συγκεκριμένες λίστες σημείων. Ήδη η Ιταλική Εταιρεία Κλινικής Χημείας, που συνεργάζεται στενά με ομάδα εμπειρογνωμόνων κυτταρομετρίας ροής, ετοιμάζει «σχολείο» κυτταρομετρίας, που θα υποβληθεί στο ESCCA, για να υιοθετηθεί από τις εθνικές εταιρείες και ενδεχόμενα να μεταφέρεται και σε χώρες, που δεν μπορούν να το καλύψουν μόνες τους. Η εμπειρία των εξεταζομένων θα μπορούσε να πιστοποιείται από τις αντίστοιχες επιστημονικές εταιρείες και θα μπορούσε να δημιουργηθεί μητρώο των ασχολούμενων με την κυτταρομετρία. Επιλεγμένη βιβλιογραφία Αναφορές με κατευθυντήριες οδηγίες •Standardization of cytokine flow cytometry assays BMC Immunology 2005, 6:13 •Guideline for the flow cytometric enumeration of CD34+ haematopoietic stem cells PREPARED BY THE CD34+ HAEMATOPOIETIC STEM CELL WORKING PARTY* Clin. Lab. Haem. 1999, 21, 301–308 •International standardized approach for flow cytometric residual disease monitoring in chronic lymphocytic leukaemia Leukemia (2007), 1–9 •Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) (Cytometry B July 2010) •Phenotyping Myeloma : (Cytometry B July 2010) Αναφορές σχετικές με διαπίστευση Schwartz, A., Fernández Repollet, E., Vogt, R. and Gratama, J. W., Standardizing flow cytometry: construction of a standardized fluorescence calibration plot using matching spectral calibrators. Cytometry (1996), 26: 22–31. A. Schwartz, G. E. Marti, R. Poon,J. W. Gratama, E. Fernández-Repollet. Standardizing flow cytometry: A classification system of fluorescence standards used for flow cytometry Article first published online: 6 JAN 1999. Bruce Greig, Teri Oldaker, Michael Warzynski, Brent Wood. 2006 Bethesda international consensus recommendations for training and education to perform clinical flow cytometry Cytometry 2006 Wim Huisman, A. Rita Horvath, David Burnett, Victor Blaton, Rozsa Czikkely, Rob T.P. Jansen, Anders Kallner, Desmond Kenny, Pika Mesko, Mario Plebani, Jose Queralto, Gerhard Schumann, Ludek Sprongl, Dalius Vitkus, Hans Wallinder and Simone Zerah. Accreditation of medical laboratories in the European Union CCLM (2007) 45(2) :268–275. Πολλές πληροφορίες σχετικά με θέματα διαπίστευσης, επικύρωσης μεθόδων, ελέγχου ποιότητας υπάρχουν στο Βιβλίο Πρακτικών του 5ου Πανελλήνιου Συνεδρίου Κυτταρομετρίας, Ολυμπία 2008. Συνεργασία κλινικής – εργαστηρίου Καφάση Ν. Μετά την αρχική κλινική εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής στην μέτρηση των CD4+ Τλεμφοκυττάρων στο AIDS κατά την δεκαετία του 1980, οι βελτιώσεις στην τεχνολογία (αύξηση της ταχύτητας, βελτίωση της ειδικότητας και ευαισθησίας) την ανέδειξαν σε ένα εξαιρετικά χρήσιμο και αποτελεσματικό εργαλείο στην διαγνωστική των αιματολογικών νοσημάτων 1. Η εκτίμηση της παρουσίας ή της απουσίας ειδικών αντιγόνων σε μεμονωμένα κύτταρα που βρίσκονται σε διάλυμα (ανοσοφαινότυπος), έδωσε την δυνατότητα 2 : να ταυτοποιηθούν κύτταρα, που προέρχονται από διαφορετικές κυτταρικές σειρές και να καθορισθεί το στάδιο διαφοροποίησης και ωρίμανσής τους να ανιχνευθούν παθολογικά κύτταρα, να γίνει λεπτομερής καταγραφή του φαινοτύπου παθολογικών κυτταρικών πληθυσμών, να γίνει εκτίμηση, για το αν η παρεχόμενη πληροφορία είναι διαγνωστική για κάποιο νόσημα και να δοθούν πληροφορίες με πρόσθετη προγνωστική αξία. Η υψηλή ευαισθησία της μεθόδου, ο συνεχώς εμπλουτιζόμενος κατάλογος δεικτών, που «ορίζουν αντιγονικά» διαφορετικούς υποπληθυσμούς των κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος και η σημασιοδότηση της προγνωστικής αξίας της έκφρασής τους σε κάθε περίπτωση, έχουν δώσει στην κυτταρομετρία ροής την θέση του χρυσού κανόνα για την μελέτη τόσο της Οξείας, όσο και της Χρόνιας Λευχαιμίας 3 και του πολύτιμου εργαλείου στην διερεύνηση των Λεμφωμάτων. Ταυτόχρονα η συνεχώς αυξανόμενη ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου την κάνει να είναι απαραίτητη για την ανίχνευση και ποσοτική μέτρηση εξαιρετικά μικρών αριθμών παθολογικών κυττάρων, ιδιαίτερα στις περιπτώσεις που τα αποτελέσματα έχουν σημαντική συνεισφορά στην λήψη παραπέρα θεραπευτικών αποφάσεων 3. Ήδη από το 1995 η συστηματική προσπάθεια και ο συνεχής προβληματισμός των ασχολουμένων με την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων και την συσχέτιση τους με την κλινική εικόνα των εξεταζομένων και την έκβαση των θεραπειών, οδήγησαν στην δημιουργία ομάδων εργασίας και την έκδοση μιας σειράς κατευθυντηρίων οδηγιών για διάφορα θέματα όπως : η βαθμονόμηση των μηχανημάτων, η επιλογή κατάλληλων συνδυασμών αντισωμάτων και φθοριοχρωμάτων, η στρατηγική ανάλυσης των δεδομένων, ο τρόπος έκφρασης των αποτελεσμάτων, κ.λ.π.1 . Παρ’ όλα αυτά εξακολουθεί πάντοτε να παραμένει καίριο το ερώτημα : Πότε πρέπει να παραγγέλλεται ένας ανοσοφαινότυπος, ή αντίστροφα πότε δεν έχει καμιά ένδειξη ; Οι σημαντικότερες ενδείξεις, για τις οποίες ένας ασθενής δικαιολογείται να παραπεμφθεί για ανοσοφαινοτυπική μελέτη είναι : η διερεύνηση κυτταροπενιών (δύο ή περισσοτέρων σειρών), η διερεύνηση υπερπλασιών διαφόρων σειρών, η παρουσία άτυπων ή βλαστικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα και ιδιαίτερα σε άλλα υγρά του σώματος, π.χ. ΕΝΥ, η παρουσία πλασματοκυττάρωσης ή μονοκλωνικής γαμμαπάθειας, η παρουσία οργανομεγαλίας ή μαζών. Σημαντική παραμένει η συμβολή του ανοσοφαινότυπου : στην διαδικασία σταδιοποίησης ήδη διαγνωσμένων νεοπλασμάτων, στην ανίχνευση πιθανών θεραπευτικών στόχων (π.χ. CD20), στην εκτίμηση της ανταπόκρισης στην θεραπεία, στην πιστοποίηση επιδείνωσης της νόσου ή υποτροπής, στην διάγνωση επιπρόσθετων αιματολογικών νεοπλασιών, που συνυπάρχουν, στην εκτίμηση επιτάχυνσης της νόσου πχ σε περιπτώσεις εκτροπής, στην εκτίμηση της πρόγνωσης της νόσου. Έλλειψη ένδειξης για ανοσοφαινοτυπική μελέτη έχουν οι παρακάτω περιπτώσεις : η ουδετροφιλία από ώριμα κύτταρα, η πολυκλωνική υπεργαμμασφαιριναιμία, η πολυκυτταραιμία, η θρομβοκυττάρωση και η βασεοφιλία. Η ακριβής και περιεκτική γνωστοποίηση των αποτελεσμάτων, που προκύπτουν από την επεξεργασία κλινικών δειγμάτων ασθενών με την χρήση της κυτταρομετρίας ροής, στους παραπέμποντες γιατρούς, είναι ένα κρίσιμο μέρος της εκτίμησης των νεοπλασιών του αιμοποιητικού συστήματος 4. Με την ομοφωνία που επετεύχθη το 1997 από Αμερικανο-καναδική ομάδα εργασίας προτάθηκε να αναφέρονται πάντοτε 5 : Στοιχεία του ασθενούς : Δημογραφικά (όνομα, ηλικία, φύλο), ο παραπέμπων ιατρός και το νοσηλευτικό ίδρυμα, στοιχεία ιστορικού και κλινικά ευρήματα, ο λόγος της παραπομπής. Στοιχεία του δείγματος : αριθμός καταχώρησης, ημερομηνία συλλογής, περιγραφή του είδους του δείγματος. Στοιχεία της προετοιμασίας και της χρώσεως : ποια αντιγόνα έχουν ελεγχθεί, έλεγχος ποιότητος του μηχανήματος, αριθμός κυττάρων που αναλύθηκαν, που έχει φυλαχθεί το αποτέλεσμα, περιγραφή των χαρακτηριστικών των κυττάρων που αναλύθηκαν, ερμηνεία του αποτελέσματος (πόρισμα) Με την ομοφωνία που επετεύχθη το 2006 από διεθνή ομάδα εργασίας έγινε εκσυγχρονισμός των παλαιότερων αμερικανο-καναδικών κριτηρίων του 19975. Σύμφωνα με τις νεώτερες κατευθυντήριες οδηγίες, που εκδόθηκαν, στην περιοχή της γνωμάτευσης προτείνεται : να περιλαμβάνονται οι κατά WHO διαφορικές διαγνώσεις, οι περιορισμοί στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων και η ταυτότητα αυτού που έκανε την ανάλυση. Υποχρεωτική είναι πλέον : η αναφορά του ποσοστού των παθολογικών κυττάρων, η αναφορά των εντάσεων των φθορισμών και οι κατανομές του φθορισμού, όταν αυτό είναι κλινικά χρήσιμο. Οι περιγραφές που προτείνονται για την κατανομή των αντιγόνων είναι : αρνητικά, θετικά και μερικώς εκφραζόμενα Η εκτίμηση πρέπει γίνεται μετά από σύγκριση της κατανομής με τον κατάλληλο αρνητικό πληθυσμό ελέγχου. Οι προτεινόμενες περιγραφές για την ένταση του φθορισμού είναι: έντονα, ασθενή και ετερογενή Για την σύγκριση της έντασης του φθορισμού του υπό μελέτη αντιγόνου χρησιμοποιείται η ένταση της έκφρασης φθορισμού του αντιγόνου αυτού στον αντίστοιχο φυσιολογικό πληθυσμό. Η έκφραση των αποτελεσμάτων με αριθμητικές τιμές σε ποσοστιαίες μονάδες, με την μορφή πίνακα, δεν είναι γενικά αρκετά ικανοποιητική και μπορεί τελικά να περιορίζει την ικανότητα του παραλήπτη να ερμηνεύσει τα αποτελέσματα και ως εκ τούτου πρέπει να αποφεύγεται. Ωστόσο, παρά την συστηματική δουλειά των ομάδων εργασίας, η καθ΄ ημέραν κλινική πράξη μπορεί να απέχει πάρα πολύ από τις κατευθυντήριες οδηγίες. Αρκετά συχνά δεν είναι σαφής ο λόγος για τον οποίο παραπέμπεται ένας ασθενής για εξέταση. Τα δημογραφικά του στοιχεία συχνά δεν είναι πλήρη και οι ενδείξεις στα παραπεμπτικά μπορεί να είναι απλά και μόνο : αναιμία, εμπύρετο. Η ελλιπής πληροφόρηση έχει συχνά ως αποτέλεσμα την χρησιμοποίηση ευρύτερων πάνελ αντισωμάτων, από ότι είναι αναγκαίο, για την διερεύνηση των συγκεκριμένων περιστατικών με επακόλουθο σημαντική αύξηση του κόστους. Με δεδομένο ότι το πηλίκον κόστος ωφέλεια πρέπει να κρατηθεί όσο γίνεται χαμηλότερο τόσο όσον αφορά το οικονομικό σκέλος, όσο και όσον αφορά την εν γένει απασχόληση του προσωπικού και την χρήση των μηχανημάτων επιβάλλεται η όσο το δυνατόν στενότερη συνεργασία του προσωπικού των κλινικών και των εργαστηρίων για την ορθολογικότερη χρήση των διαθέσιμων πόρων. Στα πλαίσια της παραστατικότερης παρουσίασης του θέματος θα παρουσιαστούν και θα συζητηθούν περιστατικά από την ρουτίνα του εργαστηρίου. Βιβλιογραφία 1. Cytometry Part B, 2007; 72B: S5-S13 2. Blood, 2008; 111(8):3941-67 3. Cytometry Part B, 2007; 72B: S2 4. Cytometry Part B, 2007; 72B:S14-S22 5. Cytometry, 1997; 30: 231-235 Cytometry Part B 72B:S14-S22 (2007), Table 5 Απο τις κατευθυντήριες οδηγίες στην Ελληνική πραγματικότητα». « Κυτταρομετρία» στο στρογγυλό τραπέζι : «Και οι τρείς είναι υπέροχες» Γ. Πατεράκης Αιματολόγος, Διευθυντής, Ανοσολογικό Εργαστήριο ΓΝΑ "Γ. Γεννηματάς" Σε ένα σεμινάριο της Ελληνικής Εταιρείας Κυτταρομετρίας είναι βαρύ φορτίο, να υπερασπίσει ο εισηγητής την Κυτταρομετρία, σε σύγκριση με τις μοριακές και κυτταρογενετικές τεχνικές και με την κλινική επιλογή που οδηγεί στην καλύτερη απόφαση. Θα πρέπει να είναι αντικειμενικός και να αποφύγει την παγίδα, ότι αφού μιλάμε "εντός έδρας", οι απόψεις του θα πρέπει να γίνουν ευνοιοκρατικά αποδεκτές από ένα κυτταρομετρικό κατά πλειοψηφία ακροατήριο. Τόσο περισσότερο μάλλον, θα πρέπει να είναι τεκμηριωμένος και να υποστηρίξει την Κυτταρομετρία σε μια ανταγωνιστική εποχή εργαστηριακών τεχνολογιών, σε μια Ιατρική βασισμένη σε ενδείξεις (evidence based medicine), που απολειστικά επιλέγει τις τεχνικές εκείνες, που στηρίζουν τη λήψη ιατρικών αποφάσεων με τον οικονομικότερο τρόπο σε σχεση με το καλύτερο αποτέλεσμα (cost το benefit analysis). Η Κυτταρομετρία ροής, έτσι όπως διαμορφώνεται στο σύγχρονο Νοσοκομείο, καταλαμβάνει τον χώρο της Κλινικής Κυτταρικής Ανάλυσης (Clinical Cell Analysis). Με τον όρο αυτό υπεισέρχεται στις βασικές τεχνικές της Αιματολογίας και ίσως στο άμεσο μέλλον και της Κυτταρολογίας και της Παθολογικής Ανατομίας. Από την άλλη πλευρά διατηρεί τον βασικό της ρόλο στον ανοσολογικό έλεγχο, για τον οποίο και αρχικά αναπτύχθηκε. Αυτά όμως δεν είναι αρκετά για να συμπληρώσουν το curriculum της σύγχρονης Κυτταρομετρίας. Δεν είναι μόνο το διαγνωστικό πλαίσιο ο στόχος, αλλά και η συμμετοχή στη διαμόρφωση των θεραπευτικών αποφάσεων. Ουσιαστικά δεν έχουμε diagnostics αλλά theranostics, όπως διατυπώνεται με τον ολοένα και συχνότερα χρησιμοποιούμενο νεολογισμό, που προέρχεται από την συγχώνευση των therapeutics και diagnostics, υποδηλώνοντας δηλαδή τεχνικές με άμεσες επιδράσεις στους θεραπευτικούς χειρισμούς. Έτσι λοιπόν υπεισέρχεται πλέον η δυνατότητα γρήγορου και ποσοτικού προσδιορισμού της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (MRD) σε μια πλειάδα αιματολογικών κακοηθειών και στο άμεσο μέλλον, η μελέτη της αντοχής στους νέους παράγοντες της στοχοποιημένης θεραπείας, όπως οι αναστολείς των κινασών, με την φωσφοκυτταρομετρική ανάλυση (phosphoflow cytometry)1. Θα αρχίσουμε όμως από τα κλασικά και μετά θα πάμε στα νέα και τα μελλοντικά δρώμενα στον χώρο της Κυτταρομετίας. Το βασικό λοιπόν ερώτημα είναι πόση Κυτταρομετρία και ποια χρειαζόμαστε σήμερα για τον αρχικό διαγνωστικό έλεγχο των ασθενών ενός Γενικού Νοσοκομείου. Για να το θέσουμε διαφορετικά, ποιες είναι οι ενδείξεις και οι κατευθυντήριες οδηγίες στη χρήση κυτταρομετρίας. Πριν μπούμε στο θέμα αυτό, θα πρέπει να λάβουμε υπ' όψη ότι η Κυτταρομετρία είναι μια δαπανηρή τεχνική με απαιτήσεις υψηλών δεξιοτήτων ανάλυσης, από μέρους του χρήστη, σε ένα κόσμο με περιορισμένα οικονομικά αποθέματα και επιτεινόμενη στενότητα τεχνικού προσωπικού. Το υψηλό κόστος της Κυτταρομετρίας οφείλεται μόνο κατά μικρό μέρος στο πάγιο κόστος της τεχνικής υποδομής (αναλυτές και ανταλλακτικά), ενώ το μεγαλύτερο κομμάτι αφορά το κόστος των μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η εξέλιξη της πολυπαραμετρικής ανάλυσης, με επέκταση σε ολοένα και περισσότερα χρώματα, δημιούργησε νέες ανάγκες σε υλικό (hardware), λογισμικό (software) και αντιδραστήρια. Στην πράξη όμως, τα περισσότερα εργαστήρια στον Ελληνικό χώρο, χρησιμοποιούν ακόμη τα κλασικά πρωτόκολλα, με τριπλούς έως πενταπλούς συνδυασμούς. Εν τούτοις η διεθνής επιστημονική κυτταρομετρική κοινότητα και τα Ευρωπαϊκά συνεργαστικά πρωτόκολλα (πρβλ.Εuroflow), συνιστούν συνδυασμούς 6-8 χρωμάτων, με διάθεση επέκτασης σε περισσότερα στο εγγύς μέλλον. Έτσι λ.χ. για την ανίχνευση της MRD στην ΟΛΛ, οι κατευθυντήριες οδηγίες συνστούν συνδυασμούς 6 χρωμάτων και πάνω, μιλώντας για χαμηλή ευαισθησία και ειδικότητα των πρωτοκόλλων με 3-4 χρώματα2. Κάτω από αυτές τις συνθήκες ίσως να φαίνονται αιρετικές κάποιες φωνές ή απόψεις (όπως και του υποφαινομένου) που υποστηρίζουν οτι σε ορισμένες περιπτώσεις more may be less or less may be more. Γενικά θα πρέπει να ομολογήσουμε οτι η πολυπαραμετρική κυτταρική ανάλυση έλυσε τα χέρια των εργαστηρίων, με την δημιουργία πρωτοκόλλων, με δυνατότητα διάκρισης πολλαπλών κυτταρικών υποπληθυσμών. Αυτό εξ' άλλου αποτελεί και το βασικό πλεονέκτημα της σύγχρονης κυτταρομετρίας. Παράλληλα μειώθηκε ο αριθμός των σωληναρίων που παρασκευάζονται για απλές μετρήσεις ρουτίνας, όπως οι λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί. Από την άποψη αυτή, η αύξηση των χρωμάτων φαίνεται αποδοτική σε κάθε επίπεδο, οικονομοτεχνικό και διαγνωστικό. Από έξι σωληνάρια διπλών συνδυασμών, που ήταν σε εφαρμογή μόλις μια δεκαετία πριν, σήμερα χρησιμοποιούμε 1 ή 2 συνδυασμούς 5 έως 8 χρωμάτων, που μας καλύπτουν σαφώς καλύτερα. Ο χρόνος και το κόστος ανάλυσης μειώθηκαν. Περισσότερο όμως το πρώτο παρά το δεύτερο. Το κόστος των αντισωμάτων στον τόπο μας διαχρονικά, περιέργως εμφανίζει μια σταθερότητα και φυσικά δεν παρουσιάζει μειωτικές τάσεις, όπως συμβαίνει με τις μοριακές τεχνικές. Έτσι ένα κόστος 12 αντισωμάτων από 6 FITC-PE διχρωμίες, συγκρινόμενο με εκείνο μιας οκταχρωμίας, με ένα πρωτόκολλο, που περιέχει νέα δαπανηρότερα φθοριοχρώματα, δεν εμφανίζει τόσο μεγάλη απόκλιση προς τα κάτω. Τοποθετώ εαυτόν ανάμεσα σε εκείνους που πιστεύουν ότι τα πολλά χρώματα δεν αναμένεται να μειώσουν θεαματικά το κόστος της σύγχρονης κυτταρομετρίας και για κάποιους λόγους που θα αναλύσουμε πιο κάτω, ίσως πιθανόν και να το αυξήσουν. Είναι γεγονός ότι όταν κάποιος διαθέτει ένα νέο όπλο, υπάρχει τάση να το χρησιμοποιήσει. Στην σύγχρονη κυτταρομετρία ένα μεγάλο μέρος της πολυπαραμετρικής ανάλυσης καταλαμβάνουν τα λεγόμενα "συνδετικά" αντισώματα. Η ανάλυση λ.χ. της οξείας λευχαιμίας, βρήκε επαναστατική εξέλιξη με την χρήση του CD45 με το λεγόμενο "βλαστικό παράθυρο". Κανείς δεν διανοείται σήμερα να μη εφαρμόσει το CD45 ως συνδετικό αντίσωμα στα πρωτόκολλά του. Με τον τρόπο αυτό όμως αυξάνεται το κόστος χωρίς να αυξάνεται ο συνολικός αριθμός των διαφορετικών αντισωμάτων. Μπορεί να θέλουμε 20-30 αντισώματα για την πλήρη ανάλυση μιας οξείας λευχαιμίας, αλλά χρησιμοποιούμε επιπλέον 10-15 δόσεις CD45, που αποτελούν ένα σημαντικό μέρος του κόστους της εξέτασης. Αν λοιπόν γίνει κοστολόγηση, ακόμη και με τις "αρχαίες" τιμές του ΦΕΚ του 1992 (προ 20 ετίας σχεδόν, παραμένει εν χρήσει ακόμη) με τα 10 ευρώ περίπου ανά "μονοκλωνικό αντι-ορό", τότε το κόστος ανάλυσης της οξείας λευχαιμίας φτάνει τα 30-45 μονοκλωνικά, ήτοι 300-450 ευρώ. Στο κόστος αυτό θα πρέπει να προσθέσουμε εκείνο των κυτταρογενετικών και μοριακών τεχνικών, φτάνοντας το διπλάσιο ή και το τριπλάσιο. Αυτό είναι αναγκαίο, αφού η πρόγνωση της οξείας λευχαιμίας, ουσιαστικά έτσι όπως διαμορφώνεται σήμερα, είναι μοριακή και κυτταρογενετική. Οι διαγνωστικές κατηγοριοποιήσεις των Οξειών Λευχαιμιών του Παγκοσμίου Οργανισμού Υγείας από το 2001 με περαιτέρω αναθεώρηση το 2008, ολοένα αντικαθιστούν περισσότερες μορφολογικές-φαινοτυπικές λευχαιμικές οντότητες με μοριακές-κυτταρογενετικές αντίστοιχες. Εδώ φαίνεται λοιπόν ο υπέροχος ρόλος των μοριακών και κυτταρογενετικών τεχνικών. Κάνοντας λοιπόν το δικηγόρο του διαβόλου και ίσως προβλέποντας τα επιχείρήματα των επομένων δύο εισηγητών, θα μπορούσα να αντιμετωπίσω τους εύλογους ισχυρισμούς, ότι αν πιθανόν χρειαστεί να περιορίσουμε το κόστος της εργαστηριακής διάγνωσης, αυτό πρέπει να γίνει εις βάρος της Κυτταρομετρίας ροής. Περιφανές παράδειγμα οι Λευχαιμίες και τα Λεμφώματα, όπου ο κλινικός θα στηριχτεί αποφασιστικά στα μοριακά και κυτταρογενετικά δεδομένα, για την διαμόρφωση της πρόγνωσης, της θεραπείας και της παρακολούθησης της MRD και γιατί όχι και της ανίχνευσης της αντοχής στη θεραπεία με τους νέους βιολογικούς παράγοντες, λόγω μεταλλάξεων, που φυσικά και αυτές θα ανιχνευτούν με μοριακές τεχνικές. Η νέα ταξη πραγμάτων λοιπόν, με βάση τα ανωτέρω θα μπορούσε να βασιστεί μόνο στις κλασικές τεχνικές, για μια αδρή διάγνωση, όπως και προ 25 ετίας. Η χρυσή βάση (gold standard) θα απαρτίζεται από μορφολογία και κυτταροχημεία και μια περιορισμένη κυτταρομετρία ροής, αρκετή μόνο για τη διαπιστωση λεμφικής ή μη λεμφικής διαφοροποίησης ή μιας Τ ή Β λεμφικής σειράς. Μια σαφώς μικρότερη επένδυση θα ήταν αρκετή, ενώ στη συνέχεια θα αναλάμβαναν οι μοριακές/κυτταρογενετικές τεχνικές και γιατί όχι και οι μικροσυστοιχίες (micro-arrays) για μια κλινικά χρήσιμη κατάταξη και πρόγνωση, απορροφώντας τα πενιχρά οικονομικά αποθέματα προς όφελος του ασθενούς και κατά προέκταση και του συστήματος. Φυσικά θα προσπαθήσω να σας πείσω ότι δεν έχουν έτσι τα πράγματα και να σας τεκμηριώσω γιατί η Κυτταρομετρία είναι υπέροχη, παίζοντας τον κομβικότερο ρόλο στη σύγχρονη κυτταρική διάγνωση, μειώνοντας παράλληλα το συνολικό κόστος (σε χρόνο και χρήμα). Η σύγχρονη διαγνωστική προσέγγιση εξετάζει προσεκτικά το θέμα των χρονικών πλαισίων. Είναι κατανοητό γιατί κάνουμε απεικονιστικές εξετάσεις και έχουμε άμεσα ευρήματα. Με το ίδιο σκεπτικό θα δούμε ποιές ενδείξεις κάνουν άμεση αναγκαιότητα την διαγνωστική χρήση της κυτταρομετρίας. Ο στόχος είναι τριπλός: 1) να βρούμε ένα άτυπο κύτταρο και να τεκμηριώσουμε μια οριστική τελική διάγνωση (σενάριο άμεσης διάγνωση με ένα βήμα, για συντομία θα αναφερόμαστε ως Δ1) 2) να τεκμηριώσουμε ότι πρόκειται για ειδική κατηγορία νεοπλασίας και υποκατηγορία ακόμη και να προσφέρουμε ένα στενό διαφοροδιαγνωστικό πλαίσιο. Στην περίπτωση αυτή ο έλεγχος θα πρέπει να συνεχιστεί για πληρέστερη τεκμηρίωση, αλλά τα ευρήματα της κυτταρομετρίας θα χρησιμοποιηθούν στον προγραμματισμό του περαιτέρω ελέγχου, μειώνοντας το χρόνο και το κόστος της συνολικής προσέγγισης (σενάριο διάγνωσης με την κυτταρομετρία σαν αναγκαίο και κομβικό βήμα προγραμματισμού, για συντομία Δ2) 3) να κατευθύνουμε αλλού τη διάγνωση και να αποκλείσουμε πιθανά σενάρια, όπως σε περιπτώσεις ανοσολογικής ενεργοποίησης που μοιάζει με λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα, σε λευχαιμοειδείς αντιδράσεις και αντιδραστικά στοιχεία σε άλλο υποκείμενο νόσημα (για συντομία Δ3). Θα αναφέρουμε ένα παράδειγμα που καλύπτει και τα τρία σενάρια, την σπληνομεγαλία και την διάγνωση του σπληνικού λεμφώματος3. Εχουμε Δ1 σενάριο στην περίπτωση της τεκμηρίωσης παρουσίας κυττάρων λευχαιμίας από τριχωτά κύτταρα, που γίνεται, ως γνωστόν, εύκολα με κυτταρομετρία ροής, ακόμη και με μικρά ποσοστά στο αίμα, βάζοντας οριστκή και τελική διάγνωση. Ενα Δ2 σενάριο είναι η ανίχνευση μονοκλωνικού Β πληθυσμού ενός λεμφώματος χαμηλής κακοηθείας με στενό διαφοροδιαγωστικό πλαίσιο σπληνικού λεμφώματος (οριακής ζώνης, λεμφοπλασματοκυτταρικό λέμφωμα, αταξινόμητο ερυθρού πολφού). Εδώ με την εικόνα αυτή αν και δεν έχουμε ιστολογική διάγνωση, τα στοιχεία χρησιμοποιούνται για περαιτέρω θεραπευτικό προγραμματισμό, αποφεύγοντας κατά τους ειδικούς, την διαγνωστική σπληνεκτομή. Τέλος ένα συχνό Δ3 σενάριο είναι το σύνδρομο λοιμώδους μονοπυρήνωσης με αυξημένα T8, NK, πολυκλωνικά Β λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα που εφησυχάζουν τον θεράποντα ότι δεν αντιμετωπίζει λέμφωμα ή λευχαιμία. Στη διάγνωση των Οξειών Λευχαιμιών, που αναφερθήκαμε προηγουμένως, η Κυτταρομετρία είναι ένα πολύτιμο Δ2 διαγνωστικό μέσο. Όχι μόνο δεν αποτελεί περιττό κόστος, αλλά βάζει τις βάσεις για ένα προγραμματισμένο μοριακό και κυτταρογενετικό έλεγχο στη συνέχεια. Οι δείκτες που χρησιμοποιούνται στο αρχικό panel της ΟΛ δεν έχουν μόνο αδρό διαγνωστικό ρόλο, αλλά παρουσιάζουν ειδική κυτταρογενετική συσχέτιση. Σε μία πρόσφατη ανασκόπηση χρησιμοποιείται ο όρος των surrogate markers της κυτταρομετρίας για την πρόβλεψη των γενετικών βλαβών4. Μάλιστα η προσωπική μας εμπειρία, ειδικά στην Β-Οξεία Λεμφοβλαστική Λ, σε συνεργασία με το εργαστήριο μοριακής κυτταρογενετικής FISH (ΣΙ Παπαδημητρίου, προσωπική επικοινωνία) είναι ότι, αν εφαρμόσουμε ειδικό διαγνωστικό αλγόριθμο με βάση τα δεδομένα της Κυτταρομετρίας, πετυχαίνουμε μείωση του κόστους του μοριακού κυτταρογενετικού ελέγχου κατά 37,8%. Ο έλεγχος της κλωνικότητας των Β λεμφοκυττάρων στο αίμα, τον μυελό, αλλά και σε όλα τα προσβάσιμα βιολογικά δείγματα, είναι μια Δ2 διαγνωστική κυτταρομερική προσέγγιση, που μπορεί να κατευθύνει τον έλεγχο σε ένα Β λεμφοϋπερπλαστικό νόσημα. Το κόστος δεν είναι υψηλό και η πολυπαραμετρική κυτταρομετρία καθιστά τον έλεγχο οικονομικό και αξιόπιστο. Μια σειρά άλλων προσδιορισμών, χωρίς να έχει τα βασικά πλεονεκτήματα της Β κλωνικότητας, μπορεί να δώσει πληροφορίες επιπέδου Δ3. Αντίστοιχο παράδειγμα είναι οι δείκτες φλεγμονής όπως το CD64 στα πολυμορφοπύρηνα και το CD16 στα μονοκύτταρα. Η αυξημένη έκφραση ΝΚ δεικτών σε Τ4 και Τ8 λεμφοκύτταρα και η μελέτη της επιλεκτικότητας των TCRVb με κυτταρομετρικά κλωνογράμματα, έχει κάνει εφικτή μια γρήγορη Δ2 διαγνωστική προσέγγιση στις λεμφοκυτταρώσεις από μεγάλα κοκκώδη λεμφοκύτταρα (LGL, που μάλιστα φαίνεται ότι είναι αρκετά συχνό εύρημα, στην εποχή της κυτταρομετρίας). Μελλοντικοί στόχοι Δ2 επιπεδου είναι η ανίχνευση νεοπλασματικών μη αιμοποιητικών κυττάρων στα εξιδρωματικά υγρά5 και η αναζήτηση υπόπτων CD30 θετικών κυττάρων σε λεμφαδένες, για την νόσο Hodgkin6. Η κυτταρομετρία πλέον γίνεται διαγνωστικό μέσο πρώτης γραμμής, όχι μόνο για τον Αιματολόγο, αλλά και για πολλές ειδικότητες, που αναζητούν την ταχύτητα και τα άμεσα οφέλη από τα ευρήματά της. Αν μάλιστα αποδειχθεί, ότι ο μέσος χρόνος διάγνωσης, μειώνεται με την χρήση της Κυτταρομετρίας στο Γενικό Νοσοκομείο, τότε το οικονομικό όφελος, από τη μείωση του συνολικού χρόνου εσωτερικής νοσηλείας θα είναι σημαντικός και θα αντισταθμίσει κατα πολύ το υψηλό κόστος της τεχνικής. Στο σημείο αυτό νομίζουμε ήρθε η κατάλληλη στιγμή να εξετάσουμε την σκοτεινή πλευρά της κατάχρησης της Κυτταρομετρίας και της επιβάρυνσης του εργαστηρίου σε μια εποχή με περιορισμένο τεχνικό προσωπικό και υλικά αποθέματα. Η κατάχρηση έχει δύο πρόσωπα, εκείνο που επιβάλλεται στο εργαστήριο από τους κλινικούς και εκείνο που αναπαράγει το ίδιο το εργαστήριο, όταν δεν έχει κλινικές πληροφορίες και δε εξετάζει την μορφολογία των κυττάρων. Η επιτυχία της κυτταρομετρίας σε γρήγορες και εύστοχες διαγνώσεις, δημιουργεί την εντύπωση οτι μπορεί να λύσει όλα τα προβλήματα ή μάλλον όταν ο έλεγχος φαίνεται να μη οδηγεί πουθενά, η κυτταρομετρία να αποτελεί σανίδα σωτηρίας για τον κλινικό. Πολλαπλά δείγματα αίματος και μυελού έρχονται στο εργαστήριο κυτταρομετρίας, αναλύονται και διεκπεραιώνονται χωρίς να προκύπτει κάτι διαγνωστικά χρήσιμο. Θα μπορούσε να υποστηρίξει κανείς μια χρησιμότητα τύπου Δ3, αλλά η εναλλακτική ερμηνεία είναι η κατάχρηση της τεχνικής λόγω άγνοιας των βασικών της ενδείξεων. Ο κλινικός πρέπει να κατανοήσει ότι το δυνατό σημείο της κυτταρομετρίας είναι η μελέτη ενός ατύπου κυττάρου ή ενός ιστού με αυξημένη πιθανότητα παρουσίας ενός ατύπου κυττάρου. Με βάση αυτη τη υπόθεση, αν λ.χ. υπάρχει ένα block λεμφαδένων, είναι περισσότερο αποδοτική η γρήγορη κυτταρομετρική ανίχνευση ατύπων κυττάρων σε υλικό λεμφαδένα παρά στο αίμα ή τον μυελό του ασθενούς. Η μορφολογία είναι πολύτιμη για να οδηγήσει στην ανάγκη ενός ελέγχου κυτταρομετρίας. Δεν συνιστάται προφανώς σε καμμιά περίπτωση κυτταρομετρική ανάλυση ρουτίνας αίματος και μυελού χωρίς ένδειξη. Από την άλλη πλευρά όταν η ένδειξη είναι σαφής, η κυτταρομετρία πρέπει να υπερβεί τα καθιερωμένα και να τεθεί σε χρήση λόγω των γνωστών της πλεονεκτημάτων, αδιάφορα αν φαίνεται ανορθόδοξη η προσέγγιση. Παράδειγμα αποτελεί η κυτταρομετρική ανάλυση κυτταρικού εναιωρήματος από επεξεργασμένη δοκίδα οστικού μυελού, όταν έχουμε ξηρή αναρρόφηση μυελού ή κακό δείγμα μυελού με υπέρμετρη αιματηρή πρόσμιξη και όταν υπάρχει έντονη υπόνοια διήθησης του μυελού από άτυπο κύτταρο. Το ίδιο το εργαστήριο κυτταρομετρίας μπορεί να επιβαρύνει τον εαυτό του και τον προϋπολογισμό του. Οι ενδείξεις πολύ συχνά δεν είναι σαφείς και οι κλινικές πληροφορίες, στην καλύτερη περίπτωση, είναι επιγραμματικές. Συχνά ο κλινικός δεν συζητάει τον προβληματισμό του με τον φάκελο του ασθενούς ανά χείρας, στο εργαστήριο, ελλείψει χρόνου, και ο εργαστηριακός ακολουθεί δαιδαλώδη πορεία διαγνωστικής αναζήτησης, ξοδεύοντας χρόνο και μονοκλωνικά αντισώματα. Η μορφολογία των κυττάρων συχνά αγνοείται. Σε ορισμένες περιπτώσεις μάλιστα τα ραντεβού της αιματολογικής κλινικής με το εργαστήριο κλείνονται με fax, διατηρώντας ένα ελάχιστο επίπεδο κλινικοεργαστηριακής επικοινωνίας. Μόνο όταν ο κλινικός αντιληφθεί ότι το εργαστήριο θα τον βοηθήσει και διαθέσει χρόνο και σκέψη, ώστε να τοποθετήσει σωστά τις προτεραιότητές του, τότε η κυτταρομετρία θα αποβεί αποδοτικότερη για όλους (θεράποντα, εργαστήριο, ασθενή και σύστημα υγείας). Εδώ λοιπόν φαίνεται ο υπέροχος ρόλος του συνειδητοποιημένου κλινικού. Ως συμπέρασμα όλων αυτών θα μπορούσαμε να πούμε ότι και η Κυτταρομετρία ροής έχει γίνει τα τελευταία χρόνια πραγματικά "υπέροχη". Δεν είναι ανεξάρτητη από την κυτταρογενετική και την μοριακή βιολογία, αλλά συνδέεται άριστα λειτουργικά μαζί τους και με τον τρόπο αυτό το σύνολο γίνεται αποδοτικότερο και οικονομικότερο. Παράλληλα η Κυτταρομετρία ισχυροποιεί το χώρο του παραδοσιακού Αιματολογικού εργαστηρίου, που δεν μπορεί να μείνει πλέον με μοναδικό του όπλο την κυτταρομορφολογία. Ουσιαστικά η κυτταρομετρία και η μορφολογία είναι η νέα "κυτταρο-μορφολογία" όχι μόνο στην αιματολογία, αλλά ίσως στο άμεσο μέλλον, στην κυτταρολογία και την παθολογοανατομία. Ο κλινικός που θα μάθει να αξιολογεί και να χρησιμοποιεί σωστά την κυτταρομετρία, θα ωφελήσει πρώτιστα τους ασθενείς του, αλλά έμμεσα και το εργαστήριο κυτταρομετρίας, που υποφέρει μόνιμα από τις κακές ενδείξεις αποστολής δειγμάτων και από την απουσία επικοινωνίας, μεταξύ κλινικής και εργαστηρίου. Και έτσι στο τέλος, και υπό αυτές τις προϋποθέσεις, και οι τρεις (Κυτταρομετρία-Μοριακές τεχνικές και Κλινική) θα είναι υπέροχες! Βιβλιογραφικές αναφορές 1. Todd M. Covey, Modulated multiparametric phosphoflow cytometry in hematological malignancies: technology and clinical applications. Best Practice & Research Clinical Haematology 23:319–331, 2010. 2. M Bruggemann, A Schrauder, T Raff, H Pfeifer, M Dworzak, OG Ottmann, V Asnafi, A Baruchel, R Bassan, Y Benoit, A Biondi, H Cave, H Dombret, AK Fielding, R Foa, N Gokbuget, AH Goldstone, N Goulden, G Henze,D Hoelzer, GE Janka-Schaub, EA Macintyre, R Pieters, A Rambaldi, J-M Ribera, K Schmiegelow, O Spinelli, J Stary, A von Stackelberg, M Kneba, M Schrappe and JM van Dongen, also on behalf of the European Working Group for Adult Acute Lymphoblastic Leukemia (EWALL) and the International Berlin–Frankfurt–Munster Study Group (I-BFM-SG) Standardized MRD quantification in European ALL trials: Proceedings of the Second International Symposium on MRD assessment in Kiel, Germany, 18–20 September 2008, Leukemia, 24, 521–535, 2010. 3. E Iannitto and C Tripodo. How I diagnose and treat splenic lymphomas. Blood, 117: 2585-2595, 2011. 4. E. Paietta Surrogate marker profiles for genetic lesions in acute leukemias. Best Practice & Research Clinical Haematology 23:359–368, 2010. 5. NA. Kentrou, NJ. Tsagarakis, K Tzanetou, M Damala, KA. Papadimitriou, D Skoumi, A Stratigaki, NI. Anagnostopoulos, E Malamou-Lada, P Athanassiadou, G Paterakis. An improved flow cytometric assay for detection and discrimination between malignant cells and atypical mesothelial cells, in serous cavity effusions, Cytometry (under publication) 6. JR. Fromm, SJ. Kussick, and BL. Wood. Identification and Purification of Classical Hodgkin Cells from Lymph Nodes by Flow Cytometry and Flow Cytometric Cell Sorting. Am J Clin Pathol,126:764-780, 2006. Μοριακή-Κυτταρογενετική Γιώργος Γεωργίου Αιματολόγος, Επιμελητής Β΄, Αιματολογική Κλινική ΕΚΠΑ, Λαϊκό Νοσοκομείο Η διάγνωση και παρακολούθηση της πορείας των αιματολογικών νοσημάτων βασίζεται στη συνδυασμένη χρήση της μορφολογίας, των κυτταροχημικών χρώσεων, της ιστολογίας, του ανοσοφαινότυπου, του κυτταρογενετικού ελέγχου και των μοριακών τεχνικών. Είναι σαφές ότι το πιο σημαντικό στοιχείο στην αιτιοπαθογένεια και τον καθορισμό της πρόγνωσης των αιματολογικών νοσημάτων είναι η υποκείμενη γενετική βλάβη(ες). Η μοριακή βλάβη καθορίζει τη βιολογία, την πρόγνωση και συχνά τη χρήση συγκεκριμένης θεραπείας σε ένα αιματολογικό νόσημα.Οι γενετικές διεργασίες που συμβαίνουν σε μοριακό επίπεδο στα αιματολογικά νοσήματα, έχουν επιβάλλει την ανάπτυξη μιας πληθώρας τεχνικών που χρησιμοποιούνται στην κατάταξη και διάγνωση αιματολογικών νοσημάτων με βάση τους μοριακούς παθογενετικούς μηχανισμούς και στο σχεδιασμό στοχευμένων θεραπευτικών χειρισμών. Οι μοριακές τεχνικές έχουν γίνει αναπόσπαστο στοιχείο της καθημερινής κλινικής πρακτικής στην Αιματολογία, ενώ αρκετές είναι ακόμη σε ερευνητική χρήση μόνο. Οι μοριακές τεχνικές στην Αιματολογία χρησιμοποιούνται για: 1.Ανίχνευση μεταλλάξεων 2. Ανίχνευση κλωνικότητας Β και T λεμφοκυττάρων 3. Ανίχνευση έκφρασης χιμαιρικών γονιδίων 4. Ποσοτικοποίηση έκφρασης γονιδίων 5. Παρακολούθηση υπολειμματικής νόσου 6. Ανίχνευση διαφορικής έκφρασης γονιδίων 7. Ανίχνευση περίσσειας/έλλειψης γενετικού υλικού Ι. Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία Η κατάταξη της ΟΜΛ κατά WHO 2008 βασίζεται στη μορφολογία, τον κυτταρογενετικό έλεγχο, το ιστορικό (πχ προηγηθείσα ΧΜΘ), αλλά επιπλέον και σε μοριακούς δείκτες (μεταλλάξεις γονιδίων): Κατάταξη ΟΜΛ WH0 2008 Acute myeloid leukemia with recurrent genetic abnormalities AML with t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1 AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 APL with t(15;17)(q22;q12); PML-RARA AML with t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL AML with t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214 AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1 AML (megakaryoblastic) with t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1 Provisional entity: AML with mutated NPM1 Provisional entity: AML with mutated CEBPA Acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes Therapy-related myeloid neoplasms Acute myeloid leukemia, not otherwise specified (NOS) Acute myeloid leukemia with minimal differentiation Acute myeloid leukemia without maturation Acute myeloid leukemia with maturation Acute myelomonocytic leukemia Acute monoblastic/monocytic leukemia Acute erythroid leukemia Pure erythroid leukemia Erythroleukemia, erythroid/myeloid Acute megakaryoblastic leukemia Acute basophilic leukemia Acute panmyelosis with myelofibrosis (syn.: acute myelofibrosis; acute myelosclerosis) Myeloid sarcoma (syn.: extramedullary myeloid tumor; granulocytic sarcoma; chloroma) Myeloid proliferations related to Down syndrome Transient abnormal myelopoiesis (syn.: transient myeloproliferative disorder) Myeloid leukemia associated with Down syndrome Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm Acute leukemias of ambiguous lineage Acute undifferentiated leukemia Mixed phenotype acute leukemia with t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1 Mixed phenotype acute leukemia with t(v;11q23); MLL rearranged Mixed phenotype acute leukemia, B/myeloid, NOS Mixed phenotype acute leukemia, T/myeloid, NOS Provisional entity: Natural killer (NK)–cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Η πρόγνωση των ασθενών με ΟΜΛ εξαρτάται από παράγοντες που έχουν σχέση με τον ασθενή (ηλικία, φυσική κατάσταση) αλλά και από παράγοντες όπως ο καρυότυπος και μεταλλάξεις γονιδίων όπως FLT-3, NPM-1, CEBPA, κλπ. κυρίως σε ασθενείς ηλικίας μικρότερης των 60 και με καρυότυπο ενδιάμεσης πρόγνωσης. Με βάση τα ευρήματα από τον κυτταρογενετικό και τον μοριακό έλεγχο, γίνεται προσπάθεια τα τελευταία χρόνια να δημιουργηθούν προγνωστικές ομάδες με βάση τις οποίες μπορούν να ληφθούν θεραπευτικές αποφάσεις: Πρόγνωση Ευνοΐκή t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1 inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 Μετάλλαξη NPM1 χωρίς FLT3-ITD (φυσιολογικός καρυότυπος) Μετάλλαξη CEBPA (φυσιολογικός καρυότυπος) Μετάλλαξη NPM1 και FLT3-ITD (φυσιολογικός καρυότυπος) Αμετάλλακτο NPM1 και FLT3-ITD (φυσιολογικός καρυότυπος) Αμετάλλακτο NPM1 χωρίς FLT3-ITD (φυσιολογικός καρυότυπος) t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL Άλλες κυτταρογενετικές ανωμαλίες inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1 t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214 t(v;11)(v;q23); Αναδιατάξεις MLL –5 ή del(5q); –7; abnl(17p); Σύνθετος καρυότυπος Ενδιάμεση Ι Ενδιάμεση -II Κακή Τα τελευταία χρόνια αναγνωρίζονται μεταλλάξεις γονιδίων ή μεταβολή στην έκφρασή τους στις ΟΜΛ που φαίνεται ότι έχουν προγνωστική σημασία (ειδικά σε ασθενείς με φυσιολογικό καρυότυπο): Μοριακές βλάβες σε ΟΜΛ με φυσιολογικό καρυότυπο Name Prevalence Chromosome Expression Prognosis FLT3-ITD 30-40% 13q12 Mutation Unfavorable MLL-PTD 5-11% 11q23 Mutation/overexpression Unfavorable IDH-1 ~10-15% 2q33.3 Mutation Unfavorable IDH-2 ~5-10% 15q26.1 Mutation Unfavorable BAALC 65.7% 8q22.3 Over-expression Unfavorable ERG 25% 21q22 Over-expression Unfavorable NPM-1 50-60% 5q35 Mutation Favorable CEBPα 15-20% 19q13.1 Mutation Favorable FLT3-TKD 5-10% 13q12 Mutation No clear effect MN1 NA 22q11 Over-expression Unfavorable WT1 10.5% 11p13 Mutation Unfavorable Οι πιο συχνές μεταλλάξεις στην ΟΜΛ αφορούν στα γονίδια FLT3 και NPM1, που βρίσκονται συνολικά στους μισούς ασθενείς με ΟΜΛ. Θεωρητικά τα δυο αυτά γονίδια θα μπορούσαν να είναι στόχοι για ανίχνευση υπολειπόμενης νόσου με PCR. Όσον αφορά το FLT3, η πιο συχνή μετάλλαξη είναι εσωτερικός σε σειρά διπλασιασμός (FLT3-ITD) (1).Mεταλλάξεις του ΝΡM1 είναι πιο σταθερές σε σύγκριση με τις μεταλλάξεις FLT3-ITD και είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν στην ανίχνευση υπολειπόμενης νόσου (2). ΟΜΛ Χιμαιρικά μετάγραφα Σε μια μελέτη 5876 ασθενών με ΟΜΛ προσδιορίστηκε η συχνότητα και το είδος των καρυοτυπικών αλλοιώσεων (3). Στον παρακάτω πίνακα αναφέρονται τα ποσοστά των αντιμεταθέσεων που οδηγούν στην παραγωγή χιμαιρικών μεταγράφων και που ανευρέθησαν στο σύνολο των ασθενών της μελέτης. Χιμαιρικό μετάγραφο t(1;22)(p13;q13) inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26) t(3;5)(q21 25;q31 35) t(6;9)(p23;q34) t(8;21)(q22;q22) t(9;22)(q34;q11) and variants t(9;11)(p21 22;q23) t(10;11)(p11 14;q13 23) t(6;11)(q27;q23) t(11;19)(q23;p13) t(15;17)(q22;q21) και παραλλαγές * inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) * Αρ. Ασθενών (%) 1 (< 0.5) 69 (1) 26 (<0.5) 42 (1) 421 (7) 47 (1) 61 (1) 34 (1) 24 (<0.5) 30 (1) 788 (13) 284 (5) Μέση ηλικία (εύρος) 37 43 (18-59) 30.5 (16-58) 44 (19-59) 40 (16-59) 43 (22-58) 38 (16-58) 33.5 (16-59) 33 (17-57) 35.5 (16-57) 39 (16-59) 38 (16-59) t(11;17)(q23;q12); ZBTB16-RARA; t(11;17)(q13;q12); NUMA1-RARA; t(5;17)(q35;q12); NPM1-RARA και STAT5B-RARA (η τελευταία έχει φυσιολογικό χρωμόσωμα 17 στην κυτταρογενετική ανάλυση). Σημασία μοριακής παρακολούθησης χιμαιρικών μεταγράφων στην ΟΜΛ Χρήσιμες εφαρμογές της ανίχνευσης ελάχιστης υπολειμματικής νόσου είναι η έγκαιρη εκτίμηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία προκειμένου να βελτιωθεί η κατάταξη σε ομάδες κινδύνου και να αποφασιστεί έτσι η περαιτέρω θεραπεία καθώς και η παρακολούθηση μετά το τέλος της θεραπείας προκειμένου να ανιχνευθεί επικείμενη υποτροπή και να χορηγηθεί έγκαιρα κατάλληλη θεραπεία. Οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία Μετά τη θεραπεία εφόδου στην ΟΠΛ η μορφολογική, κυτταρογενετική και μοριακή εκτίμηση της ανταπόκρισης πρέπει να γίνεται με προσοχή. Μορφολογικά μπορεί να αναγνωρίζονται παθολογικά κύτταρα ακόμα και 40-50 ημέρες μετά τη θεραπεία εφόδου και ομοίως μπορεί να αναδειχθεί κυτταρογενετικά ή με FISH η ύπαρξη t(15;17) ειδικά σε σύντομο χρονικό σημείο μετά τη θεραπεία εφόδου. Μοριακή εκτίμηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία εφόδου με RT-PCR δεν έχει κλινική χρησιμότητα λόγω της καθυστερημένης επίτευξης ωρίμανσης των βλαστών στη θεραπεία με ATRA και επομένως δεν πρέπει να λαμβάνονται κλινικές αποφάσεις με βάση την ανεύρεση θετικότητας στο μοριακό έλεγχο. Αντίθετα, nested RT-PCR για PML-RARA σε δείγμα μυελού των οστών μετά τον τελευταίο κύκλο θεραπείας (μετά το τέλος της θεραπείας εδραίωσης) δίνει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τον κίνδυνο υποτροπής της νόσου (4). Επίτευξη μοριακής ύφεσης σε αυτή τη χρονική στιγμή αντιπροσωπεύει θεραπευτικό στόχο στην ΟΠΛ γιατί συνδέτεαι με μειωμένο κίνδυνο υποτροπής. Ασθενείς που βρίσκονται θετικοί με RT-PCR σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή μετά το πέρας της θεραπείας εδραίωσης, πρέπει να υποβάλλονται εκ νέου εντός 2 εβδομάδων σε μυελόγραμμα και μοριακή επιβεβαίωση της θετικότητας. Σε αυτή τη χρονική στιγμή θεραπευτική παρέμβαση φαίνεται να συνοδεύεται από γρήγορη επίτευξη μοριακής ύφεσης και αποφυγή μορφολογικά έκδηλης υποτροπής της νόσου (5). ΟΜΛ με αναδιατάξεις του Core Binding Factor (CBF): t(8;21), inv(16)(p13q22) ή t(16;16)(p13;q22) Αν και ασθενείς με t(8;21)(q22;q22), inv(16)(p13q22) και t(16;16)(p13;q22) έχουν καλή πρόγνωση, ωστόσο ένα σημαντικό ποσοστό αυτών των ασθενών θα υποτροπιάσει και θα καταλήξει από τη νόσο. Μοριακοί δείκτες (πχ μεταλλάξεις C-KIT) και έλεγχος υπολειμματικής νόσου σε διάφορες χρονικές στιγμές στη διάρκεια της θεραπείας έχουν χρησιμοποιηθεί προκειμένου να ανιχνευθούν ασθενείς με αυξημένη πιθανότητα υποτροπής. Πολλές μελέτες έχουν δείξει την παρουσία του χιμαιρικού γονιδίου RUNX1-RUNX1T1 με nested RT-PCR σε ασθενείς με ΟΜΛ t(8;21) αρκετά χρόνια μετά την επίτευξη πλήρους ύφεσης με χημειοθεραπεία. Ομοίως έχει βρεθεί και παραμονή του χιμαιρικού γονιδίου και σε ασθενείς μετά από αλλογενή μεταμόσχευση. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι θετική nested RT-PCR κατά τη διάρκεια πλήρους ύφεσης δε σημαίνει κατ’ ανάγκη και υποτροπή του νοσήματος. Σε μια μελέτη των S. Lane et al εξετάστηκε η προγνωστική χρησιμότητα διαδοχικής μέτρησης υπολειμματικής νόσου σε δείγμα μυελού των οστών σε CBF ΟΜΛ με RQ-PCR. Τα επίπεδα της υπολειμματικής νόσου στη διάγνωση, μετά τη θεραπεία εδραίωσης και μετά τη θεραπεία εδραίωσης δεν παρείχαν πληροφορίες για τον κίνδυνο υποτροπής. Ωστόσο, αύξηση >ή=1 λογάριθμο των τιμών του χιμαιρικού μεταγράφου σε οποιοδήποτε σημείο σε σχέση με το επίπεδο που βρισκόταν σε δείγμα μυελού ύφεσης, συνδεόταν με μικρότερη επιβίωση και επικείμενη μορφολογική υποτροπή. Υποτροπές γινόταν κατά μέσο όρο 60 ημέρες (45 - 272) μετά τη λογαριθμική αύξηση (6). ΙΙ. Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία Στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία των ενηλίκων ο καρυότυπος επίσης έχει σημαντική προγνωστική σημασία, με την αντιμετάθεση t(9;22) και τις αναδιατάξεις του MLL να παρέχουν πολύ κακή πρόγνωση. Εκτός από την ανίχνευση κυτταρογενετικών μεταβολών και όπως έχει φανεί από τα δεδομένα που έχουν συλλεγεί από παιδιατρικούς ασθενείς, η εκτίμηση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου στην ΟΛΛ φαίνεται ότι είναι εξαιρετικά μεγάλης σημασίας. Στην ΟΛΛ ανίχνευση ελάχιστης υπολειμματικής νόσου γίνεται με κυτταρομετρία ροής και PCR/Q-PCR. Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιεί την έκφραση έκτοπων δεικτών στους λεμφοβλάστες για την ακριβή ταυτοποίηση του λευχαιμικού κλώνου, κάτι που διευκολύνει σε μεγάλο βαθμό την ανίχνευση της υπολειπόμενης νόσου ακριβώς λόγω του παθολογικού φαινοτύπου των λευχαιμικών κυττάρων. Στην PCR χρησιμοποιούνται οι αναδιατάξεις των γονιδίων των αντιγονικών υποδοχέων (βαρειά αλυσίδα των ανοσοσφαιρινών, αντιγονικός υποδοχέας Τ λεμφοκυττάρων) που μπορούν να έχουν εφαρμογή σε περίπου 80% των ασθενών με ΟΛΛ για την ανίχνευση υπολειμματικής νόσου καθώς επίσης και συγκεκριμένες γονιδιακές αναδιατάξεις (πχ BCR/ABL) που ανιχνεύονται τόσο με nested PCR αλλά και με ποσοτική PCR. Αρκετές μελέτες είχαν δείξει ότι σε παιδιά με ΟΛΛ, ανίχνευση υπολειμματικής νόσου με ποιοτική nested PCR μετά τη θεραπεία εφόδου και σε διάφορες χρονικές στιγμές κατά τη θεραπεία εδραίωσης καθορίζει την έκβαση και έχει προγνωστική σημασία, ενώ μπορεί σε μεγάλο ποσοστό να προβλέψει τις υποτροπές της νόσου (7). Η κλινική σημασία της ανίχνευσης υπολειμματικής νόσου εξαρτάται από τη χρονική στιγμή που γίνεται ο καθορισμός της. Στην παιδιατρική ΟΛΛ χρησιμοποιείται στην εκτίμηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία εφόδου και επιτρέπει την αναγνώριση ασθενών χαμηλού και υψηλού κινδύνου υποτροπής και την αντίστοιχη θεραπευτική προσαρμογή σε μείωση ή εντατικοποίησης της χορηγούμενης θεραπείας. Γρήγορη, μεγάλη μείωση των λευχαιμικών κυττάρων (<10-3 την ημέρα 15 της θεραπείας εφόδου) είναι ευνοϊκός παράγοντας στην παιδιατρική ΟΛΛ, καθώς ασθενείς που επιτυγχάνουν αυτή τη μείωση υποτροπιάζουν σε πολύ μικρότερο ποσοστό σε σύγκριση με τους ασθενείς που έχουν υψηλότερο ποσοστό υπολειπόμενης νόσου (8). Επιπλέον, φαίνεται ότι προγνωστική σημασία έχει και η ποσοτικοποίηση της υπολειπόμενης νόσου σε παιδιατρική ΟΛΛ στην πρώτη υποτροπή. Οι Eckert et al. χρησιμοποίησαν ποσοτική PCR (QPCR) για την ανίχνευση υπολειμματικής νόσου σε 30 ασθενείς με ΟΛΛ σε πρώτη υποτροπή μετά τη χορήγηση χημειοθεραπείας. Η επιβίωση ελευθέρας νόσου μεταξύ δύο ομάδων (με επίπεδο νόσου <103 ή 103 ) ήταν σημαντικά διαφορετική (86% έναντι 0%, αντίστοιχα P <0.0001) (9). Βασισμένοι στα αποτελέσματα αυτών των μελετών για την αξία της ποσοτικής μέτρησης της υπολειπόμενης νόσου στην παιδιατρική ΟΛΛ, σε πολλά θεραπευτικά πρωτόκολλα έχει ενσωματωθεί η εκτίμηση της υπολειμματικής νόσου σε αρχικά στάδια της θεραπείας σα βοηθητικός παράγοντας για τον καθορισμό της πρόγνωσης των ασθενών. Η μελέτη BFM-AIEOP 2000 για την παιδιατρική ΟΛΛ (Γερμανία, Ιταλία, Αυστρία, Ελβετία) βασίζεται κυρίως στην εκτίμηση της υπολειμματικής νόσου την ημέρα 33 και 78 με δύο Ig/TcR στόχους με ευαισθησία τουλάχιστον 10-4. Υψηλά επίπεδα υπολειπόμενης νόσου ( 103) οδηγούν στην αλλαγή θεραπευτικής στρατηγικής με εντατικοποίηση της θεραπείας ή αλλογενή μεταμόσχευση. Στην ΟΛΛ των ενηλίκων έχουν γίνει διάφορες μελέτες για την αξία του καθορισμού της υπολειμματικής νόσου με διάφορες τεχνικές και κυρίως με PCR και ποσοτική PCR. Υπάρχουν ενδείξεις για την ΟΛΛ των ενηλίκων ότι όπως και στα παιδιά γρήγορη μείωση της υπολειμματικής νόσου μετά τη θεραπεία είναι σημαντικός παράγοντας καθορισμού της πρόγνωσης (10). Η βασική διαφορά στην ΟΛΛ των ενηλίκων είναι ότι η μείωση του αριθμού των λευχαιμικών κυττάρων γίνεται με πιο αργό ρυθμό σε σύγκριση με τα παιδιά και πολύ λιγότεροι ασθενείς επιτυγχάνουν αρνητικοποίηση της υπολειμματικής νόσου στο τέλος της θεραπείας εφόδου. Ωστόσο υψηλά επίπεδα υπολειμματικής νόσου σε οποιοδήποτε σημεία μετά τη θεραπεία εφόδου σχετίζεται με μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής και η προγνωστική αξία μεγαλώνει σε μετέπειτα χρονικά σημεία (μήνες 6-9). Η γερμανική μελέτη για τους ασθενείς με ΟΛΛ GMALL έδειξε ότι ποσοτικοποίηση της υπολειπόμενης νόσου κατά τη διάρκεια της θεραπείας μπορούσε να αναγνωρίσει προγνωστικές υποομάδες κινδύνου στους ασθενείς με ΟΛΛ σταθερού κινδύνου (standard risk) που μπορεί να επωφεληθούν από εξατομικευμένη θεραπεία (πχ εντατικοποίηση ή μεταμόσχευση). Ασθενείς με γρήγορη μείωση της υπολειπόμενης νόσου σε λιγότερο από 10-4 ή κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης την ημέρα 11 και την ημέρα 24 είχαν 3ετή επιβίωση ελευθέρας νόσου 100%. Αντίθετα οι ασθενείς με υπολειπόμενη νόσο 10-4 μέχρι την εβδομάδα 16 είχαν επιβίωση ελευθέρας νόσου 5,8% και ολική επιβίωση 45,1%. Σε αντίθεση με τα παιδιά, στους ενήλικες ακριβώς λόγω της αρκετά πιο αργής μείωσης της υπολειμματικής νόσου, θεραπευτικές αποφάσεις δεν πρέπει να λαμβάνονται στο τέλος της θεραπείας εφόδου γιατί είναι πολύ νωρίς και μόνο σε κλινικές μελέτες προς το παρόν χρησιμοποιείται σαν κριτήριο θεραπευτικών επιλογών (GMALL) (11). Ποσοτική μέτρηση της υπολειπόμενης νόσου φαίνεται ότι έχει προγνωστική σημασία και στους ενήλικες με Ph+ Β-ΟΛΛ, όπου η υπολειπόμενη νόσος μπορεί να υπολογιστεί με μέτρηση των bcr/abl μεταγράφων. Σε μια μελέτη 42 ασθενείς με Β-ΟΛΛ Ph+, με πλήρη αιματολογική ανταπόκριση μετά τη θεραπεία εφόδου, χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: σε αυτούς με καλή μοριακή ανταπόκριση (>2 log μείωση των μεταγράφων μετά τη θεραπεία εφόδου και >3log μείωση μετά τη θεραπεία εδραίωσης) και σε αυτούς με μικρή μοριακή ανταπόκριση που είχαν υψηλότερα ποσοστά υπολειπόμενης νόσου στα δύο χρονικά σημεία. Η πιθανότητα ολικής επιβίωσης ήταν 48% για αυτούς που είχαν καλή μοριακή ανταπόκριση σε αντίθεση με 0% επιβίωση σε αυτούς με μικρή μοριακή ανταπόκριση (P=0.0026) (12). ΙΙΙ. Χρόνια Μυελογενής Λευχαιμία Η Χρόνια Μυελογενής Λευχαιμία (ΧΜΛ) είναι μια νεοπλασματική νόσος του αίματος που οδηγεί στην κλωνική αύξηση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Η επίπτωση της ΧΜΛ είναι 1-2 περιστατικά, ανά 100.000 άτομα το χρόνο. Στην Ελλάδα, υπολογίζεται ότι υπάρχουν περίπου 1200 ασθενείς με ΧΜΛ. H ΧΜΛ διαγιγνώσκεται συνήθως στη χρόνια φάση και αν αφεθεί χωρίς θεραπεία μεταπίπτει σε επιταχυνόμενη φάση μετά από τρία έως πέντε έτη και τέλος σε βλαστική κρίση. Λευκοκυττάρωση με αριστερή στροφή, ηωσινοφιλία, βασεοφιλία και σπληνομεγαλία είναι χαρακτηριστικά στη χρόνια φάση. Στη βλαστική κρίση υπάρχει παρουσία βλαστών (μυελικής ή στο 25% των περιπτώσεων λεμφικής σειράς) σε ποσοστό >20%. Η ύπαρξη της ΧΜΛ ήδη, από το 1960 συνδέθηκε με την ανεύρεση του χρωμοσώματος Φιλαδέλφεια (Ph χρωμόσωμα) που δημιουργείται από αμοιβαία μετάθεση μεταξύ των χρωμοσωμάτων 9 και 22 στις χρωμοσωμικές περιοχές q34 και q11 αντίστοιχα: t(9;22)(q34;q11). Αποτέλεσμα αυτής της μετάθεσης είναι η δημιουργία ενός υβριδικού mRNA και τελικά της υβριδικής πρωτεΐνης bcr-abl. Η υβριδική πρωτεΐνη bcr-abl εμφανίζει παθολογικά αυξημένη δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης (ΤΚ) και είναι υπεύθυνη για την δημιουργία της ΧΜΛ. Η διάγνωση απαιτεί την ανάδειξη της αντιμετάθεσης BCR-ABL είτε με καρυότυπο είτε με RT-PCR είτε με FISH. Κατά τη διάρκεια της χρόνιας φάσης, η ΧΜΛ αντιμετωπίζεται με imatinib (αναστολέα της κινάσης abl). Τακτική παρακολούθηση χρειάζεται για να διαπιστωθεί αν οι ασθενείς ανταποκρίνονται επαρκώς στη θεραπεία και για αυτό το λόγο έχουν αναπτυχθεί συστάσεις παρακολούθησης: Ορισμός Παρακολούθηση Κάθε 1-2 εβδομάδες μέχρι φυσιολογική γεν αίματος και μετά κάθε 3 μήνες • • WBC <10.000/μl Plt <450.000/μl Όχι πρόδρομες μορφές κοκκιοκυττάρων <5% βασεόφιλα Αψηλάφητος σπλήνας Κυτταρογενετική ανταπόκριση • • • • • Πλήρης: 0% Ph+ Μερική: 1–35% Ph+ Ελάσσονα: 36–65% Ph+ Ελάχιστη: 66–95% Ph+ Χωρίς ανταπόκριση: >95% Ph+ Τους μήνες 3 και 6 από την έναρξη της θεραπείας και μετά κάθε 6 μήνες μέχρι πλήρη κυτταρογενετική ανταπόκριση και μετά κάθε 12 μήνες Μοριακή ανταπόκριση • Πλήρης: μη ανιχνεύσιμο bcrabl μετάγραφο Μείζονα bcr-abl/abl ≤0.1% Κάθε 3 μήνες ή κάθε 6 μήνες σε πλήρη κυτταρογενετική και μείζονα μοριακή Πλήρης αιματολογική ανταπόκριση • • • • Αντίσταση στο Imatinib Μια κοινή αιτία της ανεπαρκούς δράσης είναι μικρή συμμόρφωση στη θεραπεία. Όταν υπάρχει αντίσταση, συχνά υπάρχουν μεταλλάξεις του BCR-ABL στην περιοχή τυροσινικής κινάσης (13). Αυτές επηρεάζουν τη δέσμευση του imatinib και κάνουν δυσκολότερη τη δράση του. Επίσης μπορεί να υπάρχουν επιπλέον κυτταρογενετικές βλάβες που προκαλούν αντίσταση στη θεραπεία. Σε περίπτωση αντοχής ή αστοχίας της θεραπείας θα πρέπει να ληφθούν θεραπευτικές αποφάσεις. Η αύξηση της δόσης στα 600-800 mg μπορεί να βελτιώσει την ποιότητα της ανταπόκρισης (14). Εάν η αύξηση της δόσης δεν έχει κανένα αποτέλεσμα, ο ασθενής θα πρέπει να λαμβάνει αναστολέα τυροσινικής κινάσης 2ης γενιάς (dasatinib, nilotinib) και ταυτόχρονα να γίνεται κυτταρογενετικός έλεγχος καθώς και έλεγχος μεταλλάξεων που μπορεί να προσφέρουν αντοχή στη θεραπεία. Οι ασθενείς με ανθεκτική στο imatinib μετάλλαξη δε θα ωφεληθούν από αύξηση της δόσης αλλά ενδεχομένως θα ωφεληθούν από αλλαγή θεραπείας σε Nilotinib ή Dasatinib. Σε ασθενείς με μετάλλαξη T315I, κανένας αναστολέας δεν είναι δραστικός και οι ασθενείς θα πρέπει να οδηγούνται σε αλλογενή μεταμόσχευση όταν είναι δυνατό. IV. Ph αρνητικά Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα Στα «κλασσικά» Ph αρνητικά Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα περιλαμβάνονται η Αληθής Πολυκυτταραιμία (ΑΠ), η Ιδιοπαθής Θρομβοκυττάρωση (ΙΘ) και η Πρωτοπαθής Μυελοΐνωση (ΠΜ). Λιγότερο συχνά Ph αρνητικά Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα είναι η Χρόνια Ουδετεροφιλική Λευχαιμία, Χρόνια Ηωσινοφιλική Λευχαιμία, η Μαστοκυττάρωση και άλλες νοσολογικές οντότητες με χαρακτηριστικά μυελοϋπερπλαστικών νοσημάτων χωρίς κάποια ιδιαίτερη κλινική, φαινοτυπική ή μοριακή σφραγίδα (Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα, αταξινόμητα). Μερικές μυελικές νεοπλασίες με μυελοϋπερπλαστικά χαρακτηριστικά όπως η Χρόνια Μυελομονοκυτταρική Λευχαιμία και η άτυπη Χρόνια Μυελογενής Λευχαιμία κατατάσσονται ως Μυελοδυσπλαστικά/Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα ενώ χωριστή κατηγορία αποτελούν τα νοσήματα που φέρουν αναδιατάξεις των γονιδίων PDGFRA, PDGFRB, ή FGFR1 και συνοδεύονται από ηωσινοφιλία. Τα Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα (ΜΥΝ) είναι αρκετά ετερογενή με διαφορετικά κλινικά χαρακτηριστικά, παθογενετικούς μηχανισμούς και κλινική πορεία. Η ανακάλυψη μιας συγκεκριμένης μετάλλαξης στην κινάση JAK2 στις περισσότερες περιπτώσεις ασθενών με Αληθή Πολυκυτταραιμία οδήγησε σε δραστική αλλαγή της κατάταξης και των κριτηρίων διάγνωσης των Μυελοϋπερπλαστικών Συνδρόμων (15). Οι παθογενετικοί μηχανισμοί στα Ph αρνητικά ΜΥΝ είναι πιο σύνθετοι απ’ό,τι αρχικά πιστευόταν. Ωστόσο, συχνά ανευρίσκεται διαταραχή λειτουργίας μιας τυροσινικής κινάσης (αποτέλεσμα μετάλλαξης ή χιμαιρισμού) που μιμείται τον κατταράκτη γεγονότων που επισυμβαίνουν μετά από τη διέγερση υποδοχέων κυτταροκινών. Η ανακάλυψη καινούργιων μεταλλάξεων στα ΜΥΝ συνεχώς διευρύνεται (πχ μεταλλάξεις στα γονίδια TET2, ASXL1, CBL, IDH κλπ) αλλά η παθογενετική τους αξία περιορίζεται από το γεγονός ότι ανευρίσκονται και σε άλλα νοσήματα εκτός από τα μυελικά νεοπλάσματα. 1. Κλασσικά ΜΥΝ: Αληθής Πολυκυτταραιμία (ΑΠ), Ιδιοπαθής Θρομβοκυττάρωση(ΙΘ), Πρωτοπαθής Μυελοΐνωση (ΠΜ) Οι τρεις κλινικές οντότητες μοιράζονται κοινά χαρακτηριστικά: το κύτταρο που έχει υποστεί εξαλλαγή είναι το πολυδύναμο αρχέγονο αιμοποητικό κύτταρο, η κυτταρική ωρίμανση είναι φυσιολογική ή σχεδόν φυσιολογική, εμφανίζουν αλληλοεπικάλυψη στην κλινική εικόνα και στην περίπτωση της ΑΠ και ΙΘ μπορεί να καταλήξουν σε ινωτικές αλλοιώσεις του μυελού. Επειδή συχνά υπάρχουν ομοιότητες των ΜΥΝ με αντιδραστικές μορφές που μπορεί να συμπεριφέρονται ως μυελοϋπερπλαστικά νοσήματα, έχει γίνει προσπάθεια ενσωμάτωσης στα διαγνωστικά κριτήρια και μοριακών δεικτών που να είναι κατά το δυνατόν ειδικοί των ΜΥΝ. Έτσι, στα διαγνωστικά κριτήρια κατά WHO 2008 των ΜΥΝ (πίνακας) περιλαμβάνονται και οι μεταλλάξεις των γονιδίων JAK2 και MPL. Στην πραγματικότητα η ανεύρεση μιας από τις μεταλλάξεις αυτές πιστοποιεί την ύπαρξη κλωνικού ΜΥΝ και αποκλείει την αντιδραστική ερυθροκυττάρωση, θρομβοκυττάρωση ή μυελοΐνωση. Από την άλλη η παρουσία τους δε διαχωρίζει τον υποτύπο ΜΥΝ εκτός ίσως από τις μεταλλάξεις στο εξώνιο 12 του JAK2 που δεν έχουν αναφερθεί σε άλλα ΜΥΝ εκτός της ΑΠ και τις μεταλλάξεις του MPL που δεν έχουν βρεθεί σε ασθενείς με ΑΠ. Διαγνωστικά Κριτήρια κατά WHO 2008 για τα «κλασσικά» Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα Κριτήρια Μείζονα Αληθής Πολυκυτταραιμία 1. Hgb >18.5 g/dL (άνδρες) ή >16.5 g/dL (γυναίκες), ή Hgb ή Hct > 99η εκατοστιαία θέση, ή Hgb >17 g/dL (άνδρες) ή >15 g/dL (γυναίκες) αν σχετίζεται με αύξηση >2g/dL από τη βασική τιμή Hb του ασθενούς και δε σχετίζεται με διόρθωση σιδηροπενικής αναιμίας, ή αυξημένη μάζα ερυθρών >25% της μέσης προβλεπόμενης τιμής 2. Παρουσία μετάλλαξης JAK2V617F ή παρόμοιας μετάλλαξης Ιδιοπαθής Θρομβοκυττάρωση 1. Plt> 450.000/μl 2.Μυελός με αυξημένο αριθμό μεγακαρυοκυττάρων, χωρίς σημαντική αύξηση κοκκιώδους ή ερυθράς σειράς 3. Δεν πληρούνται τα κριτήρια για ΑΠ, ΠΜ, ΧΜΛ, ΜΔΣ ή άλλο μυελικό νεόπλασμα 4.Παρουσία JAK2V617F μετάλλαξης ή άλλου κλωνικού δείκτη ή αποκλεισμός αντιδραστικής θρομβοκυττάρωσης 1. Υπερκυτταρικότητα μυελού για την ηλικία 2. Μειωμένα επίπεδα Εpo 3. Ανάπτυξη ενδογενούς αποικίας ερυθροβλαστών — 2 μείζονα +1 έλασσον ή το πρώτο μείζoν +2 ελάσσονα Και τα 4 κριτήρια Ελάσσονα Διαγνωστικοί συνδυασμοί Πρωτοπαθής Μυελοΐνωση 1. Αυξημένος αριθμός μεγακαρυoκυττάρων με ατυπία, σε συνδυασμό με ίνωση από αυξημένη εναπόθεση ρετικουλίνης ή/και κολλαγόνου ή σε απουσία ίνωσης, ο αυξημένος αριθμός μεγακαρυοκυττάρων πρέπει να συνοδεύεται από αυξημένη κυτταρικότητα, αύξηση κοκκιώδους σειράς και συχνά μείωση της ερυθράς σειράς (προ-ινωτική κυτταρική φάση της νόσου) 2. Δεν πληρούνται τα κριτήρια για ΑΠ, ΧΜΛ, ΜΔΣ ή άλλο μυελικό νεόπλασμα 3. Παρουσία JAK2V617F μετάλλαξης ή άλλου κλωνικού δείκτη ή αποκλεισμός αντιδραστικής ίνωσης 1. Λευκοερυθροβλαστική αντίδραση 2. Αυξημένη LDH 3. Αναιμία 4. Ψηλαφητή σπληνομεγαλία Και τα 3 μείζονα+2ελάσσονα κριτήρια Σε ασθενείς με αυξημένη αιμοσφαιρίνη, η ανάδειξη της μετάλλαξης JAK2V617F επιτρέπει τη διάγνωση ΑΠ σε πάνω από 95% των περιπτώσεων, αφού σε <2% των ασθενών με ΑΠ ανευρίσκονται μεταλλάξεις στο εξώνιο 12 του JAK2 (16).Για τη διάγνωση της ΙΘ απαιτείται αριθμός αιμοπεταλίων >450.000/μl, αποκλεισμός αντιδραστικής θρομβοκυττάρωσης και άλλων ΜΥΝ που παρουσιάζονται με θρομβοκυττάρωση και κυρίως της ΧΜΛ όπου ο αποκλεισμός της με PCR ή FISH είναι υποχρεωτικός. Θετικότητα για JAK2V617F ή MPL μετάλλαξη καλύπτει μόνο το 60-70% των περιπτώσεων ΙΘ και επομένως ιστολογική εκτίμηση οστεομυελικής βιοψίας είναι αναγκαία για τον καθορισμό της διάγνωσης (17). Στην ΠΜ επίσης η ιστολογική εξέταση παίζει σημαντικό ρόλο καθώς ανευρίσκεται εκτεταμένη εναπόθεση κολλαγόνου και ρετικουλίνης αν και από μόνη της αυτή η εναπόθεση δεν είναι διαγνωστική καθώς σε μικρή έκταση μπορεί να βρεθεί και στην ΑΠ και ΙΘ. Και στην περίπτωση της ΠΜ πρέπει να αποκλείεται η ΧΜΛ, ενώ και εδώ η ανεύρεση μεταλλάξεων JAK2V617F ή MPL αποκλείει την αντιδραστική μυελοΐνωση. Μετάλλαξη JAK2V617F (εξώνιο14) Το γονίδιο JAK2 εδράζεται στο χρωμόσωμα 9p24 και περιλαμβάνει 25 εξώνια και η πρωτεΐνη JAK2 αποτελείται από 1132 αμινοξέα. Η σημειακή μετάλλαξη, JAK2V617F, σχετίζεται με τα μυελοϋπερπλαστικά νεοπλάσματα και οι πρώτες αναφορές για την ύπαρξή της εμφανίστηκαν το 2005 (15). Η JAK2V617F προέρχεται από την αντικατάσταση Γουανίνης από Θυμίνη, στη θέση 1849, στο εξώνιο 14 του γονιδίου και η οποία έχει σαν αποτέλεσμα την αντικατάσταση της Βαλίνης από Φαινυλαλανίνη στο κωδικόνιο 617 της ώριμης πρωτεΐνης. Η JAK2V617F είναι η πιο συχνή μετάλλαξη στα Ph αρνητικά Μυελοϋπερπλαστικά Νεοπλάσματα καθώς ανευρίσκεται σε ~95% των ασθενών με Αληθή Πολυκυτταραιμία, σε ~60% των ασθενών με Ιδιοπαθή Θρομβοκυττάρωση και σε ~60% των ασθενών με Πρωτοπαθή Μυελοΐνωση. Έχει όμως βρεθεί και σε μερικούς ασθενείς με Μυελοδυσπλαστικό/Μυελοϋπερπλαστικό Σύνδρομο (στην Ανθεκτική Αναιμία με δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες και θρομβοκυττάρωση όπου ανευρίσκεται σε ποσοστό~50%) και σπάνια σε de novo Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία, Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο ή ΧΜΛ (18,19,20,21). Μεταλλάξεις εξωνίου 12 του γονιδίου JAK2 Οι μεταλλάξεις του εξωνίου 12 του JAK2 γονιδίου είναι σχετικά ειδικές στην Αληθή Πολυκυτταραιμία αρνητική στη μετάλλαξη JAK2V617F και πρωτοπεριγράφηκε το 2007. Η πιο συχνή ανάμεσα στις πάνω από 10 μεταλλάξεις του εξωνίου 12 που έχουν περιγραφεί μέχρι τώρα, είναι η μετάλλαξη N542E543del. Οι μεταλλάξεις στο εξώνιο 12 περιλαμβάνουν απαλείψεις, διπλασιασμούς και σημεικακές μεταλλάξεις που δε διασπούν το πλαίσιο ανάγνωσης (in-frame) και κυρίως αφορούν σε μια περιοχή 7 αμινοξέων (F537–E543). Οι μεταλλάξεις βρίσκονται συνήθως σε ετερόζυγη μορφή και προκαλούν αποκλειστικά ερυθροκυττάρωση με μειωμένα επίπεδα ερυθροποιητίνης ορού ενώ βρίσκονται συχνότερα σε νεαρότερες ηλικίες ασθενών κατά τη διάγνωση. Η κλινική πορεία των ασθενών φαίνεται να είναι η ίδια με αυτή των JAK2V617F-θετικών ασθενών (22). Μεταλλάξεις MPL Το γονίδιο MPL (myeloproliferative leukemia virus oncogene homolog), εδράζεται στο χρωμόσωμα 1p34, περιλαμβάνει 12 εξώνια και κωδικοποιεί τον υποδοχέα θρομβοποιητίνης (635–680 αμινοξέα). Η σημειακή μετάλλαξη MPLW515L προκαλείται από μια αλλαγή Γουανίνης σε Θυμίνη στη θέση 1544 στο εξώνιο 10, με αποτέλεσμα την αντικατάσταση της τρυπτοφάνης σε λευκίνη στο κωδικόνιο 515 της πρωτεΐνης MPL. Η σημειακή αυτή μετάλλαξη πρωτοπεριγράφηκε το 2006 σε ασθενείς με Πρωτοπαθή Μυελοΐνωση JAK2V617F-αρνητικούς και in vivo προκαλεί μυελοϋπερπλαστικό νόσημα στα ποντίκια με ίνωση μυελού θρομβοκυττάρωση. Στη συνέχεια ανευρέθηκαν και άλλες σημειακές μεταλλάξεις στο εξώνιο 10 του γονιδίου: MPLW515K, MPLW515S και MPLS505N σε ασθενείς με Ιδιοπαθή Θρομβοκυττάρωση και Πρωτοπαθή Μυελοΐνωση με συχνότητα που κυμαίνεται από 3-15% (23). 2. Μυελικά και Λεμφικά Νεοπλάσματα με Ηωσινοφιλία και αναδιατάξεις των γονιδίων PDGFRA, PDGFRB, ή FGFR1 Πρόκειται για σπάνια νοσήματα που συχνά έχουν ηωσινοφιλία. Νοσήματα με αναδιατάξεις του PDGFRA και συγκεκριμένα FIP1L1-PDGFRA παρουσιάζονται κυρίως σαν χρόνια ηωσινοφιλική λευχαιμία με συχνή αύξηση των μαστοκυττάρων. Λιγότερο συχνά παρουσιάζονται ως ΟΜΛ ή Τ-ΟΛΛ και στις 2 περιπτώσεις με ηωσινοφιλία. Νοσήματα με αναδιατάξεις του PDGFRΒ παρουσιάζονται κυρίως αλλά όχι αποκλειστικά σαν ΧΜΜΛ με ηωσινοφιλία. Νοσήματα με αναδιατάξεις του FGFR1 παρουσιάζονται σαν Τ-ΟΛΛ με ηωσινοφιλία, χρόνια ηωσινοφιλική λευχαιμία, Β-ΟΛΛ ή ΟΜΛ. Αξίζει να τονιστεί ότι σε περιπτώσεις με κλινική υποψία νοσήματος με αναδιάταξη FIP1L1-PDGFRA απαιτείται η ανάδειξή του με RT-PCR ή FISH καθώς δεν αναγνωρίζεται στην κλασσική κυτταρογενετική μελέτη. 1. Scholl S, Loncarevic IF, Krause C, Kunert C, Clement JH, Hoffken K. Minimal residual disease based on patient specific Flt3-ITD and -ITT mutations in acute myeloid leukemia. Leuk Res 2005: 29: 849–53. 2. NPM1 mutations are more stable than FLT3 mutations during the course of disease in patients with acute myeloid leukemia. Palmisano M, Grafone T, Ottaviani E, Testoni N, Baccarani M, Martinelli G Haematologica 2007 Sep;92(9):1268-9 3. Grimwade D et al. Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Research Council trials. Blood 2010 Jul 22;116(3):354-65 4. Grimwade D, Lo Coco F. Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2002;16:1959–1973 5. Esteve J, Escoda L, Martín G, et al. Outcome of patients with acute promyelocytic leukemia failing to front-line treatment with all-trans retinoic acid and anthracycline-based chemotherapy (PETHEMA protocols LPA96 and LPA99): benefit of an early intervention. Leukemia. 2007;21:446–452 6. Krauter J et al. Prognostic value of minimal residual disease quantification by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with core binding factor leukemias. JCO 2003 Dec 1;21(23):4413-22 7. van Dongen JJ, Seriu T, Panzer-Grumayer ER, Biondi A, Pongers-Willemse MJ, Corral L, et al. Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia in childhood. Lancet. 1998;352:1731–38. 8. Panzer-Grumayer ER, Schneider M, Panzer S, Fasching K, Gadner H. Rapid molecular response during early induction chemotherapy predicts a good outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000: 95: 790–4. 9. Eckert C, Biondi A, Seeger K et al. Prognostic value of minimal residual disease in relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 2001: 358: 1239–41. 10.Toubai T, Tanaka J, Ota S et al. Minimal residual disease (MRD) monitoring using rearrangement of T-cell receptor and immunoglobulin H gene in the treatment of adult acute lymphoblastic leukemia patients. Am J Hematol 2005: 80: 181–7. 11.Pott C, Schrader C, Gesk S, Harder L, Tiemann M, Raff T, et al. Clinical significance of minimal residual disease quantification in adult patients with standard-risk acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2006;107:1116–23. 12. Pane F, Cimino G, Izzo B et al. Significant reduction of the hybrid BCR/ABL transcripts after induction and consolidation therapy is a powerful predictor of treatment response in adult Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2005: 19: 628–35. 13. Hochhaus A, Kreil S, Corbin AS, et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia. 2002;16:2190–2196 14. Rea D, Etienne G, Corm S, et al. Imatinib dose escalation for chronic phase—chronic myelogenous leukaemia patients in primary suboptimal response to imatinib 400 mg daily standard therapy. Leukemia. 2009;23:1193–1196. 15. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet. 2005;365:1054–61 16. Spivak JL, Silver RT. The revised World Health Organization diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocytosis and primary myelofibrosis: an alternative proposal. Blood 2008;112:231–239 17. Thiele J, Kvasnicka HM, Vardiman J. Bone marrow histopathology in the diagnosis of chronic myeloproliferative disorders: a forgotten pearl. Best Pract Res Clin Haematol 2006;19:413–437 18. Schmitt-Graeff AH, Teo SS, Olschewski M, Schaub F, Haxelmans S, Kirn A et al. JAK2V617F mutation status identifies subtypes of refractory anemia with ringed sideroblasts associated with marked thrombocytosis. Haematologica 2008; 93: 34–40. 19. Steensma DP, McClure RF, Karp JE, Tefferi A, Lasho TL, Powell HL et al. JAK2 V617F is a rare finding in de novo acute myeloid leukemia, but STAT3 activation is common and remains unexplained. Leukemia 2006; 20: 971–978. 20. Steensma DP, Dewald GW, Lasho TL, Powell HL, McClure RF, Levine RL et al. The JAK2 V617F activating tyrosine kinase mutation is an infrequent event in both ‘atypical’ myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes. Blood 2005; 106: 1207–1209. 21. Inami M, Yamaguchi H, Hasegawa S, Mitamura Y, Kosaka F, Kobayashi A et al. Analysis of the exon 12 and 14 mutations of the JAK2 gene in Philadelphia chromosome-positive leukemia. Leukemia 2008; 22: 216. 22. Scott LM, Tong W, Levine RL, Scott MA, Beer PA, Stratton MR et al. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. N Engl J Med 2007; 356: 459–468 23. Pardanani AD, Levine RL, Lasho T, Pikman Y, Mesa RA, Wadleigh M et al. MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood 2006; 108: 3472– 3476. Η γνώμη του κλινικού Σωσάνα Δελήμπαση Η κυτταρομετρία ροής ( ΚΡ) κάνει την εμφάνισή της στην κλινική πράξη στα μέσα της δεκαετίας του 1990, αποτελώντας βασικό εργαλείο στη μέτρηση των CD4 T λεμφοκυττάρων στους ασθενείς με AIDS. Από τότε μέχρι σήμερα ένα πλήθος μονοκλωνικών αντισωμάτων έκαναν τη εμφάνιση τους. Νέες τεχνικές και βελτίωση των παλαιών, οδήγησαν στο να διευρυνθεί η χρήση της κυτταρομετρίας ροής στην κλινική πράξη. Σε ορισμένα αιματολογικά νοσήματα ο ανοσοφαινότυπος αποτελεί αναπόσπαστο στοιχείο της διάγνωσης. Οι ενδείξεις της εφαρμογής της κυτταρομετρίας ροής στην κλινική πράξη θα μπορούσε να ταξινομηθούν σε τέσσερις κυρίως ομάδες: 1. Διάγνωση και ταξινόμηση των αιματολογικών κακοηθειών. Η ικανότητα της αναγνώρισης με ακρίβεια παθολογικών κυτταρικών υποπληθυσμών, ο καθορισμός της κυτταρικής σειράς και ο καθορισμός της σταδίου ωρίμανσης , προσθέτουν βελτιωμένη αναπαραγωγιμότητα στη διάγνωση των αιματολογικών κακοηθειών. Στη χρόνια λεμφογενή λευχαιμία (ΧΛΛ) και στις οξείες λευχαιμίες (ΟΛ) η χρήση της κυτταρομετρίας ροής είναι πλέον απαραίτητη. 2. Προσδιορισμός βιολογικών παραμέτρων που σχετίζονται με την πρόγνωση. Η έκφραση ορισμένων μορίων κατά τη διάγνωση έχει συνδεθεί με την πρόγνωση ορισμένων νοσημάτων και μπορεί εύκολα να προσδιοριστεί με τον ανοσοφαινότυπο. Για παράδειγμα η υπερέκφραση του CD38 ή του ZAP-70 στη ΧΛΛ έχουν συνδεθεί με φτωχή επιβίωση των ασθενών. 3. Ανίχνευση αντιγόνων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως θεραπευτικοί στόχοι μονοκλωνικών αντισωμάτων, πχ, CD20, CD52, CD33, κλπ. Ο προσδιορισμός της παρουσίας τέτοιων αντιγόνων από τα κακοήθη κύτταρα είναι απαραίτητη γιατί εκτός των άλλων οι θεραπείες αυτές είναι πολύ ακριβές και δεν στερούνται παρενεργειών. 4. Ανίχνευση υπολειπόμενης νόσου μετά από τη θεραπεία. Η ικανότητα της κυτταρομετρίας ροής να αναγνωρίζει και να καταμετράει την παρουσία κακοήθων κυττάρων με ευαισθησία 0.01%, χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο ως δείκτης ανταπόκρισης στη θεραπεία και στη διάγνωση επικείμενης υποτροπής. Ας δούμε όμως πιο διεξοδικά σε ποιες περιπτώσεις η χρήση του ανοσοφαινότυπου θα μπορούσε να δώσει λύσεις στον κλινικό γιατρό. Κυτταροπενίες Κάθε αιματολογική κακοήθεια μπορεί να εμφανιστεί με πενίες των αιμοποιητικών σειρών. Η πενία μόνο μίας σειράς και ιδιαίτερα η αναιμία δεν αποτελούν απόλυτη ένδειξη διενέργειας ανοσοφαινότυπου, μια και μπορεί να αποτελούν εκδήλωση πολλών μη αιματολογικών νοσημάτων. Η παγκυτταροπενία πολύ συχνά συνοδεύει αιματολογικά νοσήματα και η κυτταρομετρία ροής συνιστάται. Επειδή όλες οι αιματολογικές παθήσεις μπορούν να εκδηλωθούν με παγκυτταροπενία θα πρέπει να εκτιμηθούν όλες οι σειρές. Λευκοκυττάρωση Ο αυξημένος αριθμός λευκών αποτελεί πολύ συχνή αιτία επίσκεψης στον αιματολόγο. Σε αρκετές περιπτώσεις ο ανοσοφαινότυπος περιφερικού αίματος αποτελεί τη λύση. Η διάγνωση της ΧΛΛ αποτελεί την πιο κλασική περίπτωση και λιγότερο άλλων λεμφοϋπερπλαστικών, η ασφαλής διάγνωση των οποίων απαιτεί περαιτέρω έλεγχο. Σε κάθε περίπτωση ο κλινικός γιατρός μπορεί να αξιολογήσει αν πρόκειται για παθολογικό κλώνο ή για μια αντιδραστική λεμφοκυττάρωση στα πλαίσια άλλου νοσήματος. Η μονοκυττάρωση μπορεί να αποτελεί εκδήλωση χρόνιας μυελομονοκυτταρικής λευχαιμίας ή άλλων μυελοϋπερπλαστικών συνδρόμων και η ΚΡ μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση από αντιδραστική μονοκυττάρωση. Η ηωσινοφιλία αποτελεί πολλές φορές συνοδό εύρημα της χρονίας μυελογενούς λευχαιμίας, της μαστοκυττάρωσης και Τ λεμφοϋπερπλαστικών διαταραχών. Σε αυτές τις περιπτώσεις η ΚΡ μπορεί να φανεί χρήσιμη, αν χρησιμοποιηθεί βέβαια και ο σωστός συνδυασμός μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η ΚΡ δεν ενδείκνυται συνήθως στις παρακάτω περιπτώσεις, γιατί δεν συνδέονται συνήθως με αιματολογικές κακοήθειες και αν συνδέονται δεν μπορούν να ανιχνευτούν με ΚΡ. • Ώριμη ουδετεροφιλία • Πολυκλωνική υπεργαμμασφαιριναιμία • Πολυκυτταραιμία • Θρομβοκυττάρωση • Βασεοφιλία Διάγνωση οξείας λευχαιμίας Η ΚΡ αποτελεί σήμερα βασικό εργαλείο στη σωστή διάγνωση και ταξινόμηση της οξείας λευχαιμίας. Η εποχή που ο αιματολόγος περιεργαζόταν για ώρες τα τους βλάστες στο μικροσκόπιο, για να αποφανθεί αν ο βλάστης χωρίς κοκκία είναι της μυελικής ή της λεμφικής σειράς ευτυχώς πέρασε, για το καλό κυρίως του αρρώστου. Έτσι πλέον με τα διάφορα μονοκλωνικά αντισώματα, μπορεί να γίνει διάκριση όχι μόνο ανάμεσα σε οξεία μυελογενή (ΟΜΛ) και λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ), αλλά και να τις διακρίνει στις διάφορες υποκατηγορίες. Ο ανοσοφαινότυπος ορισμένων λευχαιμιών είναι πολύ χαρακτηριστικός και συνδέεται με συγκεκριμένες ανωμαλίες που ανιχνεύονται με καρυότυπο ή FISHκαι έχουν προγνωστική αξία. Στην ΟΛΛ ο ανοσοφαινότυπος αποτελεί πολύτιμο εργαλείο στην ανίχνευση ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου και η παρακολούθηση του στα διάφορα στάδια της θεραπείας αποτελεί ασφαλές κριτήριο για την πορεία της νόσου. Στην ΟΜΛ μπορεί να διευκρινίσει αν τα άωρα κύτταρα που βλέπουμε στο μυελό μετά τη θεραπεία είναι βλάστες ή αιματογόνια και έτσι να λάβει ο κλινικός γιατρός σωστές αποφάσεις ως προς τη θεραπεία. Η ΚΡ είναι χρήσιμη και για την έγκαιρη διάγνωση υποτροπής μία λευχαιμίας πριν ακόμη ανιχνευτούν βλάστες στο περιφερικό αίμα. Πλασματοκυττάρωση και μονοκλωνική γαμμαπάθεια Η ΚΡ βοηθάει στη διαφορική διάγνωση ανάμεσα στο πολλαπλούν μυέλωμα (ΠΜ) και στο MGUS καθορίζοντας το ποσοστό των παθολογικών ή κλωνικών πλασματοκυττάρων από όλα τα πλασματοκύτταρα του μυελού. Ωστόσο ο κλινικός γιατρός μέχρι σήμερα δεν φαίνεται να εμπιστεύεται την ΚΡ όσο την ανοσοϊστοχημεία σε επίπεδο οστεομυελικής βιοψίας. Παρατήρηση άτυπων κυττάρων ή βλαστών σε σωματικά υγρά Η ΚΡ συνιστάται στην εκτίμηση άτυπων μονοπύρηνων κυττάρων που ανευρίσκονται σε σωματικά υγρά, για να αποκλείσει την παρουσία αντιδραστικών λεμφοκυττάρων και να ανιχνεύσει πιθανή κακοήθεια. Αυτό οφείλεται στη μεγαλύτερη ειδικότητα και ευαισθησία της ΚΡ από τη μορφολογία. Το ΕΝΥ αλλά και το πλευριτικό ή το περιτοναικό υγρό αποτελούν καλά υλικά για μελέτη. Όπως γνωρίζουμε η οξεία λευχαιμία και ιδίως η ΟΛΛ επινέμεται συχνά το ΚΝΣ και η έγκυρη διάγνωση είναι πολύτιμη. Συμπεράσματα Η ΚΡ είναι διαγνωστικά παραγωγική και αποτελεσματική. Η μελέτη του ανοσοφαινότυπου είναι αναπόσπαστο κομμάτι της σύγχρονης κλινικής πράξης για τον αιματολόγο. Η γνώση των ευρημάτων της ΚΡ που έχουν σχέση με τις αιματολογικές κακοήθειες είναι σημαντική για την αντιμετώπιση των ασθενών, προμηθεύοντας στοιχεία που βοηθούν στη διάγνωση, στην ταξινόμηση, στην πρόγνωση, στη θεραπεία και στην παρακολούθηση των αιματολογικών νοσημάτων. Όλα αυτά με την προϋπόθεση ότι υπάρχει σωστή συνεργασία ανάμεσα στο εργαστήριο και τον κλινικό γιατρό, ο οποίος οφείλει να παρέχει ορθές πληροφορίες. Η κυτταρομετρία ροής και η επιγενετική Ι. Κοτσιανίδης. Αιματολογική Κλινική, Ιατρική Σχολή ΔΠΘ, Aλεξανδρούπολη. Η επανάσταση της επιγενετικής έχει μεταβάλει οριστικά τις παραδοσιακές αντιλήψεις σχετικά με την παθογένεση των νεοπλασιών. Ο νεολογισμός «επιγενετική» αποδίδεται στον Conrad Waddington (1905-1975) ως «ο βιολογικός κλάδος που μελετά τις αιτιώδεις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γονιδίων και των προιόντων τους, οι οποίες προκαλούν τον τελικό φαινότυπο», ενώ ο σύγχρονος ορισμός της επιγενετικής είναι «η μελέτη των διαταραχών της γονιδιακής έκφρασης, οι οποίες δε σχετίζονται με μεταβολές της αλληλουχίας του DNA και είναι κληρονομήσιμες». Οι επιγενετικές τροποποιήσεις προκαλούνται αδρά από τέσσερις μηχανισμούς: την μεθυλίωση του DNA, τις ομοιοπολικές ή μη, ιστονικές τροποποιήσεις και την παρεμβολή του RNA. Η ανεύρεση των παραπάνω μεταβολών σε πρώιμα στάδια νεοπλασμάτων αποτελεί ισχυρή ένδειξη ανάμιξής τους στην διαδικασία της καρκινογένεσης. Αν και το επιγενετικό τοπίο είναι εξαιρετικά δαιδαλώδες, τόσο στη φυσιολογική όσο και στην κακοήθη αιμοποίηση, τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα της εισαγωγής των υπομεθυλιωτικών παραγόντων στη θεραπευτική των αιματολογικών κακοηθειών και ειδικότερα των Μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων, έχει προκαλέσει ενθουσιασμό σε ερευνητές και κλινικούς αιματολόγους, καθώς η αποκρυπτογράφηση του επιγενετικού κώδικα και των διαταραχών του αναμένεται να συμβάλλει αποφασιστικά στην επιτυχή αντιμετώπιση των κακοήθων αιματολογικών νοσημάτων. Η κυτταρομετρία ροής έχει από καιρό «εισβάλει» στο πεδίο της μοριακής βιολογίας ανταγωνιζόμενη τις κλασσικές μεθόδους της γενετικής. Ήταν άρα αναμενόμενη – αν και αδικαιολόγητα (;) καθυστερημένη η εφαρμογή της και στην επιγενετική. Πως όμως μπορούν να προσδιορισθούν κυτταρομετρικά οι επιγενετικές τροποποιήσεις; Τόσο η ολική μεθυλίωση του DNA, όσο και η ακετυλίωση των ιστονών μπορούν να μετρηθούν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα κατά της 5-μεθυλκυτοσίνης και των ιστονών, αντίστοιχα. Επιπλέον η ειδική θέσης (locus specific) μεθυλίωση μπορεί να προσδιορισθεί με κυτταρομετρία ροής με τη βοήθεια μικροσωματιδίων, ενώ και η αλληλεπίδραση πρωτεινών-DNA μπορεί να εκτιμηθεί μετά από πρόσδεση των προιόντων της συμβατικής PCR σε μικροσφαιρίδια. Τέλος, πρόσφατα προτάθηκε η ανάλυση των προτύπων έκφρασης των microRNA με τη χρήση μικροσφαιριδίων και της τεχνολογίας luminex. Η ευρεία αποδοχή των παραπάνων μεθόδων από την επιστημονική κοινότητα θα σημάνει μια νέα εποχή όχι μόνο για την κυτταρομετρία, αλλά και για την πρωτεομική γενικότερα. Δεν είναι λοιπόν ευφάνταστος όποιος οραματίζεται την ταυτόχρονη μελέτη γενετικών, επιγενετικών και σηματοδοτικών φαινομένων στον ίδιο ιστό και σε επίπεδο μονήρους κυττάρου, αποκλειστικά με κυτταρομετρία ροής. Η μοναδική ικάνοτητα της κυτταρομετρίας να μελετά (φαινομενικά) ετερόκλητα ερευνητικά πεδία, ίσως να επανασυνδέσει τους κλάδους της πολυδιασπασμένης βιολογίας ενοποιώντας την επιστημονική σκέψη μέσω της διαρκούς Αριστοτελικής υπενθύμισης: «το όλον είναι μεγαλύτερο από το άθροισμα των μερών του».
© Copyright 2024 Paperzz
