Farmaci antibatterici e farmaco-resistenza La scoperta della penicillina La storia degli antibiotici comincia quando Fleming, studiando varianti dello stafilococco, osservò che una muffa che contaminava una delle sue colture aveva inibito intorno a sé la crescita dello stafilococco Londra, 3 settembre 1928 "That's funny..." Inoltre, Fleming potè osservare che il brodo colturale in cui erano cresciuti i funghi possedeva un potente effetto inibitorio nei confronti di molti microrganismi. Poiché la muffa apparteneva al genere Penicillum, Fleming chiamò questa sostanza antibatterica penicillina Definizione e caratteristiche Antibiotici: sostanze prodotte naturalmente (metabolismo secondario) da varie specie di batteri o funghi in grado di bloccare la crescita o causare la distruzione di altri microrganismi. Chemioterapici: farmaci antibatterici prodotti per sintesi chimica Bacteriological effects are broadly considered to be bacteriostatic or bactericidal Bacteriostatic agents 9 Inhibit the growth of the infecting pathogens, preventing increases in cell numbers. 9 Therapeutic success often depends on the participation of host defence mechanisms. 9 The sulphonamides and tetracyclines are examples of bacteriostatic antibacterials. antibacterials . Bactericidal antibacterials 9 Cause the death of the pathogen and reduction in bacterial numbers. 9 Examples of bactericidal agents include aminoglycosides and β-lactams Lisi cellulare da penicillina AZIONE SELETTIVA Idealmente, una sostanza ad azione antimicrobica dovrebbe avere effetto massimo sulla cellula batterica e scarso o nessun effetto sulle cellule umane. Alcune strutture/attività metaboliche della cellula batterica differiscono significativamente da quelle delle cellule umane. Le molecole ad attività antibiotica o chemioterapica agiscono sfruttando queste differenze. Tutti i farmaci antibatterici agiscono inibendo una determinata via metabolica, per cui sono attivi solo nei confronti di batteri attivamente metabolizzanti Classification of antibacterials Antibacterial agents can be broadly classified according to mode of action (target site) and bacteriological effects. Modes of action include: 1. 2. 3. 4. inhibition of bacterial cell wall synthesis inhibition of protein synthesis inhibition of DNA/RNA synthesis inhibition of bacterial metabolism Antibiotici che agiscono sulla sintesi della parete cellulare Il peptidoglicano della parete cellulare batterica non è presente nelle cellule umane Æ rappresenta un bersaglio ideale per l’antibiotico terapia La sintesi del peptidoglicano può essere suddivisa in 3 tappe: 1. Sintesi dei precursori nel citoplasma 2. Trasporto dei precursori attraverso la membrana citoplasmatica 3. Inserimento dei precursori nella parete cellulare Rosso: inibitori prima tappa Verde: inibitori seconda tappa Blu: inibitori terza tappa Antibiotici attivi sulla prima tappa del metabolismo del peptidoglicano La 1a tappa avviene nel citoplasma, dove vengono sintetizzate le unità fondamentali della struttura portante del peptidoglicano NAG e NAM La D-CICLOSERINA è un analogo strutturale della D-alanina. Essa inibisce in maniera competitiva due enzimi coinvolti nella formazione del dipeptide D-alanil-D-alanina: la RACEMASI che converte la Lalanina nel suo stereoisomero D, e la SINTETASI che catalizza la formazione del legame peptidico tra le due molecole D-alanina La FOSFOMICINA è un analogo strutturale del fosfo-enolpiruvato. Impedisce la sintesi dell’acido N-acetil-muramico, legandosi covalentemente al sito attivo dell’enzima Piruvato-UDP-NAG trasferasi. Fosfomicina La reazione di condensazione tra UDP-N-acetil glucosamina e fosfoenolpiruvato negli stadi iniziali della sintesi del peptidoglicano rappresenta il target d’azione della fosfomicina. La rapida insorgenza di resistenza la rendono praticamente inutile in clinica. Struttura chimica della fosfomicina Cicloserina La cicloserina è una molecola ciclica. La struttura stabile dell’anello favorisce il legame alla racemasi e alla sintetasi, preferenzialmente rispetto ai substrati naturali. Ciò risulta in un’ inibizione competitiva di questi enzimi. La cicloserina è NEUROTOSSICA e NON viene usata clinicamente, eccetto per il trattamento delle infezioni da Mycobacterium tuberculosis resistenti agli altri farmaci. Struttura chimica della cicloserina e dell’analogo D-alanina Antibiotici attivi sulla seconda tappa del metabolismo del peptidoglicano La seconda tappa della sintesi del peptidoglicano avviene sulla superficie interna della membrana citoplasmatica dove l’ N-acetilmuramilpeptide viene legato da un trasportatore lipidico che trasloca la subunità completa all’esterno della membrana citoplasmatica La bacitracina inibisce la defosforilazione del trasportatore lipidico legandosi al bactoprenolodifosfato e bloccando la rigenerazione del bactoprenolomonofosfato. E’ un polipeptide ciclico tossico per l’uso clinico umano. Viene usato per trattamenti topici e come additivo alimentare per ruminanti al fine di ridurre la produzione di metanolo nel rumine. Antibiotici attivi sulla terza tappa del metabolismo del peptidoglicano La terza tappa avviene nel contesto del peptidoglicano e nello spazio periplasmico (Gram-), dove l’unità basale, liberata dal legame del trasportatore lipidico, si unisce all’ estremità in accrescimento di una catena di peptidoglicano (transpeptidazione). Molti antibiotici agiscono su questa tappa. La vancomicina e la ristocetina sono GLICOPEPTIDI che si legano all’estremità D-alanina-D-alanina del pentapeptide legato al bactoprenolo ed impediscono l’azione della transpeptidasi sequestrandone il substrato. GLICOPEPTIDI Vancomicina Teicoplanina Æ G + Via parenterale Grandi molecole difficoltà a penetrare nei batteri Gram negativi Sintesi di bersaglio a ridotta affinità: resistenza acquisita ai glicopeptidi negli enterococchi Antibiotici attivi sulla terza tappa del metabolismo del peptidoglicano: gli antibiotici β-lattamici Le operazioni terminali di polimerizzazione, transpeptidazione ed inserimento delle unità peptidoglicaniche nella parete cellulare sono catalizzate da una serie di enzimi che presentano la caratteristica di legare covalentemente la penicillina ed altri antibiotici β-lattamici noti, pertanto, come ”proteine leganti la penicillina” o PBP (Penicillin-binding proteins). Gli antibiotici β-lattamici sono analoghi strutturali del dipeptide D-alanina-D-alanina che devono la loro azione antibatterica proprio alla capacità di legarsi a questi enzimi inibendo la sintesi del peptidoglicano. Gli antibiotici β-lattamici: inibiscono le PBP coinvolte nella transpeptidazione. Beta-lactams The beta-lactam family 9 The ring structure is common to all beta-lactams and must be intact for antibacterial action. 9 Enzymes (beta-lactamases) that catalyze the hydrolysis of the beta-lactam bond render the agents inactive. 9 The penicillins and cephalosporins are the major classes of beta-lactam antibiotics, but other members of the family, particularly the carbapenems and monobactams, are the focus of new developments. Struttura chimica delle PENICILLINE Anello β-lattamico fuso all’anello tiazolidinico Antibiotici efficaci con tossicità estremamente bassa PENICILLINE Penicilline naturali: attive contro streptococchi β-emolitici e la maggior parte degli altri streptococchi, azione limitata contro stafilococchi, contro la maggior parte degli anaerobi gram +, debole attività contro bacilli gram -. Penicilline R alla penicillinasi (meticillina, oxacilina, cloxacillina): più attive rispetto quelle naturali verso gli stafilococchi. Penicilline a spettro esteso (ampicillina, amoxicillina, piperacillina): azione equivalente alle penicilline naturali; attive contro alcuni bacilli gram -. β-lattamico con inibitore delle β-lattamasi (ampicillina/sulbactam, amoxicillina/acido clavulanico, piperacillina/tazobactam): attive contro batteri produttori di β-lattamasi BATTERI GRAM-NEGATIVI Canali porinici Farmaco Farmaco PBP β-lattamasi > [antibiotico] PBP > attività Evoluzione della resistenza ai β-lattami in E. coli E. coli wil-type (era pre-antibiotica): Non produce β-lattamasi - sensibile ad ampicillina Ampicillina usata in terapia Acquisizione di plasmidi che codificano β-lattamasi (TEM-1): Resistenza acquisita ad ampicillina Cefalosporine a spettro esteso (ESCs) usate in terapia Acquisizione di plasmidi che codificano nuovi enzimi ad attività ESBL Evoluzione di TEM-1 (varianti (es. CTX-M) con attività ESBL Resistenza acquisita ad ESCs Resistenza acquisita ad ESCs Antibiotici Antibiotici beta-lattamici: gli inibitori delle beta-lattamasi Penicilline USO clinico Benzil penicillina : ° forme orali # Anche in formulazione con inibitori infezioni batteriche del tratto respiratorio superiore, polmonite, meningite, endocardite Cloxacillina, flucloxacillina° : infezioni della pelle e dei ts molli (G +), osteomielite ed artrite settica (G+) Ampicillina ° # Amoxicillina : UTI, febbre enterica, osteomielite (G-) meningite, epiglottidite, bronchite Azlocillina, piperacillina # : sepsi gravi da P. aeruginosa ed altri bacilli G – ( di solito in combinazione con un aminoglicoside) Le CEFALOSPORINE derivano dall’acido 7aminocefalosporanico, l’anello β-lattamico è fuso all’anello diidrotiazinico Le cefalosporine e le cefamicine (contengono un atomo di ossigeno al posto dello zolfo) condividono il meccanismo d’azione con le penicilline, ma hanno uno spettro antibatterico più ampio, sono resistenti a molte β-lattamasi ed hanno proprietà farmacocinetiche migliori. Classificazione DI ORDINE CRONOLOGICO, ma anche in base a: - POTENZA - SPETTRO D’AZIONE - SENSIBILITA’ ALLE β-LATTAMASI CEFALOSPORINE DI 1a GENERAZIONE Cefalotina, cefaloridina, cefacetrile CEFALOSPORINE DI 2a GENERAZIONE Cefoxitina, cefamandolo, cefuroxime CEFALOSPORINE DI 3a GENERAZIONE Cefotaxime, ceftizoxime, ceftazidime, ceftriaxone CEFALOSPORINE DI 4a GENERAZIONE Cefpirome, cefepime USO clinico CEFALOSPORINE ° forme orali Cefalexina°, Cefaclor°, Cefadroxil°: UTI Cefuroxime: infez del tratto respiratorio, UTI Cefixime°, cefpodoxime°: infez del tratto respiratorio Cefotaxime: meningiti neonatali Ceftriaxone: sepsi addominale Ceftazidime, cefpirome: sepsi severe da P. aeruginosa e altri bacilli G – CEFAMICINE Cefoxitina: CARBAPENEMICI Imipenem, meropenem: sepsi addominale sepsi severe da P. aeruginosa e altri bacilli G – antibiotico R (solitam. in combinazione con un aminoglicoside) Antibiotici che agiscono sulla membrana citoplasmatica LE POLIMIXINE - Attivi solo nei confronti dei batteri Gram – - Legano specificamente la m. e. interferendo con le proprietà osmotiche -Detergenti cationici, agiscono rimpiazzando competitivamente gli ioni Mg2+ e Ca2+ dei gruppi fosfato carichi negativamente delle membrane lipidiche. PROVOCANO la distruzione delle membrane Piuttosto TOSSICHE anche per le cell. eucariotiche. L’impiego è limitato a trattamenti topici. Polimixine: molecole costituite da un peptide ciclico, legato ad un polipeptide lineare che termina con una molecola di acido grasso. La presenza di porzione idrofila ed idrofoba consente l’inserzione tra lo strato proteico e quello lipidico alterando la permeabilità di membrana. Gli antibiotici che interagiscono con le subunità ribosomiali sono abbastanza selettivi per poter essere impiegati nella terapia antibatterica Meccanismo d’azione: inibizione della sintesi proteica I Macrolidi A. steroideo, esplica l’azione batteriostatica interagendo con il fattore extraribosomiale G (EF-G) necessario per il processo di allungamento. In presenza di a. fusidico si ha la stabilizzazione del complesso EF-G/GTP/ribosoma, con conseguente impedimento della traslocazione; il fattore di allungamento (legato all’antibiotico) non è utilizzabile e il ribosoma è incapace di muoversi lungo l’mRNA. Tetracicline Gruppo di antibiotici a struttura molecolare tetraciclica prodotti da Streptomiceti. L’ azione antibatterica è dovuta ad un blocco della sintesi proteica in una fase molto iniziale: si legano alla subunità ribosomiale 30S subito dopo il legame dell’mRNA, impedendovi l’attacco dell’aminoacil-tRNA a livello del codone d’inizio e bloccando la formazione del polisoma. - Azione batteriostatica nei confronti di Gram+ e Gram- (la dizione “antibiotici ad ampio spettro” fu usata per la 1a volta nei loro riguardi), -largamente utilizzati in campo medico ed in alcuni Paesi anche come integratori alimentari negli allevamenti animali. -A causa dell’ampio uso non medico, si è diffusa resistenza a questi farmaci, tanto che questo tipo di applicazione è oggi vivamente scoraggiato. Amminoglicosidi Streptomicina, gentamicina, etc. consistono di due o più aminozuccheri uniti da un legame glicosidico a un nucleo esoso (amminociclitolo) che generalmente è in posizione centrale. Attivi nei confronti di Gram-negativi e di alcuni batteri Gram-positivi. Mentre la maggior parte degli inibitori della sintesi proteica microbica è batteriostatica, gli aminoglicosidi sono battericidi. Classe di antibiotici oggi poco utilizzata, sia perché causa di numerosi effetti collaterali che per la frequente comparsa di resistenza batterica. Amminoglicosidi Class Generic name Gentamicin Aminoglycosides Amikacin Neomycin sulphate Netilmicin Tobramycin Mode of action Bactericidal – inhibit protein synthesis General indications Serious Gram-negative infections, septicaemia, skin infections, meningitis, biliarytract infection, acute pyelonephritis, prostatitis and endocarditis Legano irreversibilmente alla subunità ribosomiale 30S bloccando la sintesi proteica. Determinano inoltre un’alterata lettura dell’mRNA portando all’incorporazione di aminoacidi errati e causando la produzione di proteine anomale o non funzionali. Sembra esservi una stretta correlazione tra attività battericida e capacità di indurre un’errata lettura dell’mRNA. Cloramfenicolo Antibiotico ad ampio spettro d’azione Farmaco di scelta per il trattamento della febbre tifoide Inibisce la sintesi proteica legandosi alla subunità 50S in corrispondenza del sito peptidiltransferasico inibendo la formazione del legame peptidico. Tuttavia sono sensibili all’azione del cloramfenicolo anche i ribosomi mitocondriali; ciò determina l’inibizione da parte dell’antibiotico di cellule eucariotiche in rapida crescita e con elevata attività mitocondriale, quali le cellule staminali del midollo osseo. I MACROLIDI L’Eritromicina e i suoi derivati Inibiscono la sintesi proteica legandosi reversibilmente alla subunità ribosomale 50S. Spettro d’azione poco più ampio di quello delle penicilline (anche alcuni G -) Azione batteriostatica. L’eritromicina è usata per pazienti allergici ai βlattamici ¾ ¾ ¾ Clindamicina: lincosamide Struttura: Azione: blocca l’allungamento del polipeptide legandosi alla porzione 23S della subunità 50S del ribosoma Batteriostatici con meccanismo e spettro d’azione simile a quello dei macrolidi, pur avendo una struttura chimica molto diversa. L’azione dei CHINOLONI è sinergica con quella della NOVOBIOCINA (l’inattivazione della girasi è potenziata se sono colpite entrambe le due subunità costitutive) e non presenta resistenza crociata. FLUOROCHINOLONI Subunità catalitica dell’enzima (GyrA o ParC) Fluorochinoloni Fluorochinoloni DNA Subunità ATP-binding dell’enzima (GyrB o ParE) Inibizione dell’attività delle topoisomerasi batteriche responsabili del supercoiling del DNA (DNA girasi) e del rilassamento del DNA supercoiled (topoisomerasi IV) RESISTENZA AI FLUOROCHINOLONI Modificazione del bersaglio: mutazioni della subunità A e della subunità B della DNA girasi o della topoisomerasi IV Diminuita concentrazione intracellulare da ridotto influsso: ridotta permeabilità della membrana esterna da alterata espressione delle proteine di membrana Diminuita concentrazione intracellulare da aumentato efflusso: pompe di efflusso attivo dalla cellula Pompe di efflusso attivo in E. coli Inibizione della sintesi di RNA: le rifampicine - Gruppo di antibiotici isolati in Italia, dalle colture di Nocardia mediterranea - Agiscono legandosi alla subunità β dell’RNA polimerasi batterica che rendono non funzionale. -Attive nei confronti dei batteri Gram + e Gram – - fra i farmaci di elezione per il trattamento delle infezioni da micobatterio tubercolare Bersaglio mutato RNA polimerasi Topoisomerasi tipo II rRNA 23S Resistenza Rifampicina Chinoloni Linezolid Sulfamidici i primi chemioterapici usati per inibire la crescita batterica. Il sulfamidico più semplice, la sulfanilamide, agisce come analogo dell’acido p-aminobenzoico, che, a sua volta, è parte della vitamina acido folico. La sulfanilamide compete con l’acido p-aminobenzoico legandosi al sito attivo dell’enzima diidropteroatosintetasi (DHPS) bloccando la sintesi dell’acido folico, precursore degli acidi nucleici. E’ attiva contro i batteri che sono in grado di sintetizzare acido folico, ma non contro gli organismi superiori, che devono procurarselo con la dieta. Il trimetoprim è analogo dell’acido diidrofolico. Esso esercita la sua azione inibente legandosi all’enzima diidrofolato riduttasi (DHFR), catalizzante la reazione che trasforma il diidrofolato in tetraidrofolato, cofattore richiesto per la sintesi delle purine, della timina, e di alcuni aminoacidi Farmaci antibatterici Sostanze che: - inibiscono la crescita batterica a concentrazioni che non danneggiano le cellule dell’ospite - possono essere utilizzate per la chemioterapia delle infezioni batteriche Resistenza batterica ai farmaci Quando i batteri riescono a sopravvivere e moltiplicarsi in presenza di un farmaco antibatterico Log CFU/ml Batteri vivi Antibiotico resistenza Effetto batteriostatico Effetto battericida Time Fattori che influenzano l’attività antimicrobica Battere -Specie/ceppo Antibiotico - Concentrazione N. isolati S. aureus BREAKPOINT microbiologico Livello Basso moderato livello Classificazione microbiologica Wild-type Alto livello Resistenza microbiologica MIC CIPRO Resistenza batterica: definizione clinica Definiti in base a: - farmacocinetica - efficacia clinica - breakpoints microbiol. N. isolati S. aureus BREAKPOINT Microbiol. BREAKPOINTS clinici WT Classificazione clinica SE LE I IB S N IN R TE I ED M O R TE N E ST I ES MIC CIPRO Resistenza batterica Resistenza microbiologica Resistenza clinica Resistenza naturale Resistenza acquisita Resistenza naturale o intrinseca E’ una condizione di generale insensibilità ad un farmaco che si estende a tutti gli stipiti di una data specie • Al microrganismo può mancare la struttura su cui agisce l’antibiotico, come avviene con i micoplasmi che sono privi della parete cellulare e quindi insensibili alla penicillina • La struttura della parete cellulare o la membrana citoplasmatica di un microrganismo possono essere impermeabili a un antibiotico Resistenza naturale (o intrinseca) N. isolati S. aureus E. coli Specie sensibile Specie intrinsecamente resistente WT WT MIC ERM Concentrazioni raggiungibili nei tessuti Resistenza acquisita S. aureus N. isolati Specie sensibile BREAKPOINTS clinici Resistenza acquisita WT SENSIBILE IN R TE I ED M O RESISTENTE MIC ERM Tutti i ceppi di una specie batterica sono resistenti ad un farmaco La specie è INTRINSECAMENTE RESISTENTE a quel farmaco Es: gli enterococchi sono intrinsecamente resistenti alle cefalosporine Tutti o gran parte dei ceppi di una specie batterica sono sensibili ad un farmaco La specie è SENSIBILE a quel farmaco Es: Escherichia coli è naturalmente sensibile all'ampicillina Antibatterico Meccanismo di resistenza Alterazione bersaglio Beta lattamici - glicopeptidi - aminoglicosidi tetracicline Alterazione permeabilità + ++ - + ++ - + CAF - macrolidi ++ lincosamidi ++ Ac.fusidico ++ sulfonamidi ++ - trimetoprim ++ - - + chinoloni rifampicina ++ metronidazolo polimixine Inattivazione del farmaco - - + RESISTENZA CROMOSOMICA Ø Costituisce solo il 10-15% di tutte le resistenze acquisite (bassa frequenza di insorgenza) Ø Si realizza tramite un’alterazione dell’informazione genetica cromosomica mutazionale spontanea Ø L’antibiotico esercita un’azione selettiva (seleziona i mutanti resistenti, inibendo le cellule sensibili) Ø Gli stessi mutanti possono essere resistenti anche ad altri antibiotici con caratteristiche simili (resistenza crociata o crossresistenza) Ø Si trasmette verticalmente tramite la discendenza (da cellula madre a cellula figlia) Può essere: Ø one-step: è sufficiente una sola mutazione per conferire un elevato grado di resistenza Ø multi-step: sono necessarie più mutazioni perché possa instaurarsi RESISTENZA EXTRACROMOSOMICA Ø Costituisce il 90% di tutte le resistenze (alta frequenza di insorgenza) Ø Si origina per acquisizione di nuova informazione genetica che deriva da altri microrganismi e che penetra nella cellula mediante i meccanismi di coniugazione, trasformazione e trasduzione Ø Riguarda più antibiotici contemporaneamente (resistenza multipla) Ø E’ a trasmissione orizzontale (tramite lo scambio genetico) Ø Può essere trasferita anche a microrganismi appartenente a specie differenti (resistenza contagiosa) Ø E’ dovuta a geni presenti su plasmidi o trasposoni (elementi genici mobili) Nei saggi di sensibilità che si effettuano in laboratorio con isolati clinici: - non si saggiano farmaci ai quali la specie è intrinsecamente resistente - Si interpretano i risultati facendo riferimento ai breakpoints clinici Studio dell’efficacia degli antibiotici MIC e MBC Il metodo più corretto per determinare l’efficacia di un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico, la concentrazione minima inibente (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC). MIC (Minimal Inhibitory Concentration): la concentrazione minima di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica. MBC (Minimal Bactericidal Concentration): la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere i batteri. Metodi di valutazione in vitro dell’attività degli antibiotici UTILI per: ¾ predire l’efficacia del farmaco in vivo; ¾ indirizzare una terapia mirata; ¾ monitorare l'evoluzione della resistenza batterica LINEE GUIDA FORNITE DAL CLSI (Clinial and Laboratory Standards Institute) Utilizzo di ceppi standard per valutare l'accuratezza e la precisione dei test eseguiti in laboratorio Organismi che definiscono i breakpoints clinici CLSI EUCAST BSAC CA-SFM DIN NWGA SRGA CRG (USA) (ESCMID) (UK) (France) (Germany) (Norway) (Sweden) (The Netherlands) DEFINIZIONI delle tre categorie S, I, R SECONDO CLSI ¾Sensibile S: la categoria Sensibile significa che l'infezione causata dal ceppo presuntivamente responsabile dell’infezione stessa, la cui importanza è valutata sia dal microbiologo che dal clinico, puo' essere trattata con quell'antibiotico al dosaggio usuale raccomandato. ¾Intermedio I: la categoria Intermedia significa che l’infezione causata dal ceppo presuntivamente responsabile dell’infezione stessa, la cui importanza è valutata sia dal microbiologo che dal clinico, deve essere trattata con quell'antibiotico ad un dosaggio piu‘ alto di quello usuale. ¾Resistente R: la categoria Resistente significa che l'infezione causata dal ceppo presuntivamente responsabile dell’infezione stessa, la cui importanza è valutata sia dal microbiologo che dal clinico, NON puo' essere trattata con quell'antibiotico. I ceppi resistenti non sono inibiti nè da dosaggi normali, né piu’ alti, dell'antibiotico. MODALITA’ DI REFERTAZIONE DELLA SENSIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI Pseudomonas aeruginosa Piperacillina Ceftazidime 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 S 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Cefepime S 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Imipenem S 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Meropenem 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 S S Aztreonam 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Gentamicina 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Tobramicina 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 S S S Amikacina Ciprofloxacina 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 S Levofloxacina 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 S S MODALITA’ DI REFERTAZIONE DELLA SENSIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI Pseudomonas aeruginosa Piperacillina Ceftazidime 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 R 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Cefepime R 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Imipenem R 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Meropenem 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 R R Aztreonam 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Gentamicina 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 R R Tobramicina 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 R Amikacina Ciprofloxacina 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 I Levofloxacina 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 R R Antibiogramma Test per la determinazione della sensibilità batterica ai farmaci antibatterici Le varie tecniche per eseguire questo tipo di test sono sostanzialmente riconducibili a due metodi principali: • Metodo dei dischetti di diffusione • Test di diluizione in agar o brodo ANTIBIOGRAMMA (DISCO-DIFFUSIONE) È un metodo quali-quantitativo, semplice, rapido ed economico, valido per microrganismi aerobi a crescita rapida. Attualmente il test di diffusione su dischetto più utilizzato è il metodo di Kirby-Bauer, sviluppato agli inizi degli anni ’60. Acceptable inoculum density range for a Gram-negative rod TEST DI DISCO DIFFUSIONE secondo Kirby & Bauer ¾ sospensione batterica con torbidità pari a 108 UFC/ml(0.5 Mc Farland) ¾ semina a confluenza su piastre di MH agar ¾ dischetti di carta bibula dell’antibiotico da testare ¾ incubazione overnight delle piastre a 37°C ¾ valutazione dell’attività inibente impregnati della concentrazione nota MISURA DEGLI ALONI: espressa in mm, includendo il diametro del dischetto antibiotato. E. coli ATCC 25922: controllo di qualità INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Elementi genetici mobili nei batteri Coniugazione Cassetta genica Integrone Trasposone Trasposone coniugativo Integrazione/excisione Cromosoma Plasmide Coniugazione Trasduzione Trasformazione Integrazione/excisione L’antibiogramma Oggi i test di sensibilità ai farmaci antibatterici possono essere eseguiti con apparecchiature semi-automatiche in cui i batteri vengono fatti crescere in terreno liquido, in presenza di dosi prefissate dei farmaci e la lettura dei risultati, eseguita da un fotometro registratore, viene interpretata da un elaboratore elettronico, che fornisce in tal modo il significato finale. Metodo delle diluizioni progressive La sensibilità del microrganismo viene valutata in base alla crescita o meno in un terreno di coltura - che può essere solido o liquido - contenente diverse concentrazioni dell'antibiotico. Questo metodo è QUANTITATIVO e consente di determinare accuratamente oltre alla MIC anche la MBC (Minimal Bactericidal Concentration), ovvero la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere la totalità dei batteri. l'impiego è limitato a pochi casi: •trattamenti di affezioni molto serie in cui sia necessario valutare la MBC per determinare il dosaggio dell'antibiotico (es. nelle endocarditi batteriche o osteomieliti); •valutazione della sensibilità di microrganismi a lenta crescita (es. micobatteri e actinomiceti); Determinazione della Minima Concentrazione Inibente (MIC) Permette di ottenere risultati quantitativi riguardo all’attività di un antibiotico nei confronti di un agente patogeno. Consente di determinare la minima concentrazione necessaria ad inibire completamente la crescita di un batterio, detta Minima Concentrazione Inibente (MIC). La procedura richiede l’allestimento di una serie di diluizioni scalari dell’antibiotico da testare, generalmente secondo un fattore due. La Minimum Bactericidal Concentration (MBC) è generalmente superiore (2-4 volte) la MIC. Il metodo di diluizione in agar è molto simile al test di diluizione in brodo: piastre contenenti quantità variabili di antibiotico si inoculano e, quindi, viene valutata la crescita. MIC testing – microdilution broth method 0 .1 .2 .5 1 2 4 8 16 32 64 128 μg/ml A B C D E F G H each row one drug Each well is inoculated with test strain (104 CFU per well) 0 .1 .2 .5 1 2 4 8 16 32 64 128 μg/ml MIC (μg/ml) 0.2 2 0.5 16 4 0.2 2 64 A B C D E F G H (Automation possible) Recording results Useful to test a strain against several agents MIC testing – agar dilution method 0 ....... 0.25 0.5 1 2 4 ....... 128 μg/ml Series of Petri dishes of solid medium containing increasing antimicrobial concentrations MIC testing – agar dilution method 0 ....... 0.25 0.5 1 2 4 ....... 128 μg/ml Inoculate bacteria (104 – 105 CFU per spot) One strain per spot Retain the position of different strains in different plates Incubate MIC testing – agar dilution method A C B D 0 ....... 0.25 0.5 1 2 μg/ml Reading of results: Strain MIC (μg/ml) A B >128 0.5 C 4 D 1 4 ....... 128 Useful to test several strains against a single agent MIC testing – E test (diffusion method) Petri dish of MH medium evenly inoculated with standard inoculum Plastic strip containing a gradient of antibiotic concentration Incubation Inhibitory zone (oval-shaped) The point of intersection of the margin of the inhibitory zone with the strip indicates the MIC MIC testing – E test (diffusion method) Linea di regressione che correla i valori di MIC e le dimensioni degli aloni di inbizione. La linea è calcolata utizzando dischetti convenzionali. Il Laboratorio di Microbiologia Clinica deve: ¾ isolare il batterio causa dell'infezione ¾ determinare la corretta identificazione a livello di specie ¾ selezionare un’appropriata batteria di farmaci da saggiare ¾ esprimere la sensibilità batterica secondo criteri orientati alla terapia Ceppo isolato dal singolo paziente Identificazione Saggio della CMI Definizione della sensibilità / resistenza ai farmaci saggiati del ceppo di isolamento clinico (sulla base dei "breakpoints") Scelta del farmaco per la chemioterapia (fra quegli antibiotici ai quali il ceppo è risultato sensibile in vitro) chemioterapia antibiotica RAZIONALE Resistenza acquisita ai CHIINOLONI per bersaglio modificato Per mutazioni cromosomiche che modificano l’affinità delle topoisomerasi tipo II per i chinoloni Girasi: mutazioni in gyrA or gyrB Topo IV: mutazioni in parC or parE Le mutazioni sono raggruppate in certe regioni dell’enzima dette QRDR (Quinolone Resistance Determining Regions) Esistenza di due bersagli con diversa affinità per i chinoloni: Fenotipi variabili a seconda delle mutazioni I tre principali elementi che determinano la scelta di un farmaco antimicrobico ed il successivo impiego in terapia o in profilassi: il germe patogeno (identificazione e valutazione delle sensibilità e delle resistenze) il paziente ed il quadro clinico (definizione puntuale della gravità dell’infezione; attenta valutazione dei fattori clinico-biologici legati all’ospite quali la situazione immunologica e le compromissioni funzionali; considerazione di fattori socio-antropologici del paziente e di fattori organizzativi) il farmaco (considerazioni di farmacodinamica/farmacocinetica e di farmacotossicità; scelta delle vie e delle modalità ottimali di somministrazione; valutazione dei costi) SORVEGLIANZA EPIDEMIOLOGICA L’interpretazione degli scenari infettivologici delle singole realtà locali e il controllo delle infezioni nelle strutture sanitarie attraverso la sorveglianza dei ceppi microbici e delle relative resistenze.