Overlay Images（Display Menu） Overlay Image 機能は、透過光像をはじめとするグレイスケール画像と蛍光画像などを最大７種類まで任意に組み合わせて重ね合わせて表示するための機能です。各画像間で位置ズレが生じている場合は、Overlay Image ダイアログボックス内で位置修正が行えます。 Drop-in : OVERFLUO 明視野透過光像などのバックグランド（背景）画像と最大６種類の蛍光プローブ画像を合成する目的でこのコマンドを使用します。この機能により合成された画像を見ることで、バックグランド画像のどの部分が蛍光を発しているかなどが容易に判別できます。また各蛍光画像は異なる色を割り当てることができるばかりか、各画像間のバランス調整も可能です。基となる画像は、８ビットか１６ビット画像のいずれかで、独立した１つのプレーン画像か、スタック形式画像における選択されたプレーンが使用できます。なお出力される画像は２４ビットカラー画像となります。（２５６×２５６サイズの Overlay Preview ウィンドで、重ね合わせ画像のプレビューを表示確認できます。） Molecular Devices Japan KK/ Imaging Team (1/8) 操作手順： 1. Display メニューから Overlay Images を選びます。Overlay Images ダイアログボックスが現れます。 2. ＃Images スピンボックスで何枚の画像を重ね合わせるか指定します。（３枚の蛍光画像を重ね合わせる場合は透過光画像を含めるため、透過光画像を重ね合わせない場合でも４と指定します。なお最大指定枚数は７です。）注意：この時あらかじめ Meta シリーズソフトウェアで、重ね合せ処理を行うための画像が Meta ソフトウェアデスクトップに読み込まれている必要があります。 3. 異なる波長で構成されたスタック形式画像を用いる場合のみ Images from stack にチェックを入れます。それ以外の場合は、チェックを入れないで下さい。 4. 別々の画像を用いて重ね合わせる場合で、透過光画像などのバックグランド（背景）を使用する際は必ず最初の画像セレクタにそれを指定してください。バックグランド画像を使用しない場合は、[None]を選択します。 5. 重ね合わせたい画像の選択にあたり Hue カラーボックスをマウスでクリックし、指定します。なお Source をマウスでクリックすることで選択可能な画像のリストが表示されます。重ね合わせる際の色調は Hue スライダーでの選択あるいは、あらかじめ登録されている Hue リストより指定が可能です。（Edit Hue List を用いて新規に登録することも出来ます。） 6. 重ね合わせ画像の輝度バランスを自動的に調節したい場合は、Auto Balance にチェックを入れます。なお輝度バランスを任意に調整したい場合は Auto Balance のチェックを外し、それぞれの画像のバランスを数字指定します。 7. 必要であれば Overlay Brightness スピンボックスを使用し、結果画像全体の明るさを変更します。結果画像の輝度値はバックグランド画像の輝度値から数値を得るようなアルゴリズムとなっているため、原画像の一部に輝度値がゼロの素子があると結果画像の輝度値もゼロとなることにより重ね合わせた情報を失うことになるので、このような場合は Auto Balance のチェックを外し、Overlay Brightness スピンボックスの数字を変更することで重ね合わせ結果の輝度調整が行えます。 Molecular Devices Japan KK/ Imaging Team (2/8) 8. 蛍光プローブのオーバーラップしている部位を特に強調したい場合は、Boost Colocalization にチェックを入れます。 9. Dest にて出力画像の名称指定が行えます。（デフォルトでは Overlay となっています。） 10. Show Preview をチェックすることで、重ね合わせ結果のプレビューが表示されます。 Preview Image の Box-in-Box をマウスで移動することでプレビューの位置を変更できます。 Molecular Devices Japan KK/ Imaging Team (3/8) 11. プレビュー画面で画像確認した際に画像間の位置ズレを確認できた場合には、Version4.6 以降で追加された X Align、Y Align 機能を用いて重ね合わせ位置の修正を行います。位置を修正したい画像の選択にあたり Hue カラーボックスをマウスでクリックし、指定します。プレビュー画面で位置を確認しながら X Align または Y Align の調整をします。ここで X の値に正の数字を入力することで対象画像を右方向へ、不の数字を入力することで対象画像を左方向へシフトできます。注意：上記の例は意図的に位置をずらしています。また Y の値に正の数字を入力することで対象画像を下方向へ、不の数字を入力することで対象画像を上方向へシフトできます。注意：上記の例は意図的に位置をずらしています。 Molecular Devices Japan KK/ Imaging Team (4/8) 12. 準備が全て終わりましたら Apply ボタンを押します。 13. 作業が終わりましたら Close ボタンを押し、ダイアログボックスを閉じます。 Molecular Devices Japan KK/ Imaging Team (5/8) ダイアログボックスオプションの説明＃Images：重ね合わせ処理を行いたい原画像数を指定します。この時必ず透過光画像などの背景となるグレイスケール画像も枚数としてカウントします。 Images from Stack：スタック形式の画像を基画像とする場合にチェックを入れます。チェックを入れることでダイアログボックスが上のように変化し、何番目のプレーンを背景画像に指定するかをラジオボタンで選択します。なお背景画像がない場合は、No Plane is gray image を選択してください。 Hue（colored boxes）：色調の指定や画像を指定する場合に使用します。 Bal：他の重ね合わせ画像の Bal ファクタと比較しつつ、それぞれの重ねあわせにおけるスケールングファクタを指定します。デフォルトの設定値は５０です。 Molecular Devices Japan KK/ Imaging Team (6/8) X Align, Y Align：プレビュー画面で画像確認した際の画像間の位置ズレを修正します。 X の値に正の数字を入力することで対象画像を右方向へ、不の数字を入力することで対象画像を左方向へシフトでき、Y の値に正の数字を入力することで対象画像を下方向へ、不の数字を入力することで対象画像を上方向へシフトできます。 Source：重ね合わせを行う基画像を指定します。デフォルトでは一番上のセレクタには背景（明視野像）となる画像を入力するようになっています。なお Images from stack にチェックが入っている場合は、Source イメージセレクタは一つしか現れません。 Plane N is gray image：/ No Plane is gray image スタック画像を選択した場合に背景となる画像が何プレーンに当たるのかまたは、背景となる画像が含まれていないかなどをラジオボタンで指定します。 Molecular Devices Japan KK/ Imaging Team (7/8) Hue（slider）：重ね合わせ画像の色調の指定を行います。 △をマウスで移動させることで任意の色調を選ぶことが出来ます。 Hue List：ドロップダウンリストであらかじめ登録された色調の選択が出来ます。 Edit Hue List：リストの内容変更（色調や名称の設定）を行います。 Auto Balance：基となる画像の輝度バランスを自動的に調整します。このオプションが選択されている場合は、 Bal スピンボックスがグレーアウトされ操作できません。 Boost Colocalization：蛍光プローブが重なっている領域の輝度を強調処理します。 Overlay Brightness：重ね合わせた結果画像の基準輝度の設定を行ないます。デフォルトの設定値は５０になっていますが、この数値を増やすことで結果画像はより明るくなります。この機能は、結果画像の輝度値はバックグランド画像の輝度値から数値を得るようなアルゴリズムとなっているため、原画像の一部に輝度値がゼロの素子があると結果画像の輝度値もゼロとなり、重ね合わせた情報を失うことになります。このような場合は Auto Balance のチェックを外し、Overlay Brightness スピンボックスの数字を変更することで重ね合わせ結果の輝度調整が行えます。 Destination：処理後の出力先のスタック画像名を選びます。既存画像の上書き、既存画像への付けたし、または新規作成のいずれかの指定が可能です。 Box-in-Box Control：プレビュー画像の表示位置調整を行います。原画像の縦ないし横の画像サイズが２５６素子より小さい場合はこのオプションは使用できません。 Apply：処理を実行します。 Close：ダイアログボックスを閉じます。 Molecular Devices Japan KK/ Imaging Team (8/8)